組み換えタンパク質のための高生産者細胞株の再現性のある作成のための方法及び材料

专利摘要:
本発明は、真核細胞中の組み換え遺伝子産物の製造の分野に属する。本発明は、組み換え遺伝子産物の大規模製造に適した製造細胞株の迅速かつ再現性のある作成のための方法及び材料を参照する。本発明は、特定のベクター系、遺伝子組み換えした宿主細胞及び使用方法を包含する。
公开号:JP2011515094A
申请号:JP2011501156
申请日:2009-03-27
公开日:2011-05-19
发明作者:ヘルマン アンドレアス；アプツ ハリー；グロイリヒ ベネディクト
申请人:セロニック アクチエンゲゼルシャフトＣｅｌｏｎｉｃ ＡＧ；
IPC主号:C12N15-09

专利说明:

[0001] 発明の詳細な説明
１．技術分野
本発明は、真核細胞中の組み換え遺伝子産物の製造の分野に属する。特に、本発明は、組み換え遺伝子産物の大規模製造に適した高収率真核性製造細胞株の迅速かつ再現性のある作成のための方法及び材料を参照する。本発明は、特定のベクター系を含み、これは遺伝子組み換えした宿主細胞により特徴付けられ、かつ、使用方法を包含する。]
[0002] ２．背景技術
ＣＨＯ細胞株は、バイオ医薬品の製造のために最も広く使用される宿主細胞の１つである。典型的には、宿主細胞は組み換え遺伝子産物、例えばタンパク質をコードする興味のある遺伝子（ＧＯＩ）、及び、選択マーカー、例えば抗生物質性の、例えばネオマイシン又はメトトレキサート耐性の遺伝子を含有する発現コンストラクトでトランスフェクションされる。少ない割合の宿主細胞においては、発現コンストラクトは非相同性組み換えによりゲノム中にランダムに導入される。これら安定にトランスフェクションされた細胞は抗生物質化合物の選択圧下で選択される。規則遵守して作成された（regulatory compliant）単一細胞由来の細胞株を獲得するために、限定された希釈（limited dilution）によるサブクローニング工程が引き続き実施される。数百の単一細胞由来のクローンが分析されるにもかかわらず、この発現レベルはしばしば未だ弱く、これによりトランスフェクション手順の最適化又は当初に組み込まれたコピーの発現コンストラクトの増幅が必要となり、これは例えばメトトレキサートの濃度又は他の増幅系を増加させることにより行われる。この全手順は少なくとも６ヶ月かかり、時には１年間もかかる。]
[0003] このアプローチに関する主要な問題は、組み込み事象のランダムな性質である。取り囲むゲノムＤＮＡは、組み込まれた発現コンストラクトの翻訳活性に主要な作用を有する（「ポジション作用（position effect）」）。この非相同性組み込みプロセスの確率的性質のために、この組み込みは高い転写活性でもって座に指向されることができない（転写ホットスポット）。主たる哺乳類ＤＮＡは非コード性であり、かつ、このコード領域でさえ少ない程度でだけ転写活性であるために、大抵の組み込み事象は導入遺伝子の低い発現を生じるものである。要約すると、発現コンストラクトのランダム組なみ込みは導入遺伝子の発現レベルに広い変動を生じるものであり、細胞の一画分のみが高レベルの発現を示す。]
[0004] 必要な実験室的スクリーニングプロセスを回避し、かつ高生産者細胞株を作成するための時間を減少させるために、宿主細胞のゲノムの発現のホットスポットへの標的化した任意のＧＯＩの挿入のための系が所望されるものである。]
[0005] ＧＯＩをこの部位に繰り返して導入するために、この同定された部位は、配列特異的なリコンビナーゼ、例えばＣｒｅ又はＦＬＰの挿入を可能にする配列で補われていてよい。このような改変のためのＦｌｐの使用はＷＯ９２／１５６９４中に記載され、ＵＳ２００１／００３２３４１にはマーカー不含の繰り返しＤＮＡ発現カセット交換のための改変を有する。植物細胞中でのゲノムの改変のためのＣｒｅの使用はＷＯ９１／０９９５７中に記載され、ＵＳ２００６／００１４２６４Ａ１中には更なる改変を有する。]
[0006] 両方のリコンビナーゼは特定の認識部位に依存的であり、これはまず適当なゲノム性局在化でゲノム中に導入される必要がある。トランスジェニック動物の場合には、これは相同性組み換えにより達成される。]
[0007] これら特異的なリコンビナーゼを生産細胞株の作成のために使用するために、主要な問題は、相同性組み換えにより認識部位の挿入のための適した遺伝子を同定することである。この遺伝子は高度に転写されることが必要であるが、同時に、細胞にとって必須であってはならない。ミエローマ細胞又はハイブリドーマ細胞中のイミノグロブリン座は、このような適した座の例であろう。相同性組み換え及びＣｒｅを使用する配列特異的組み換えの組み合わせの使用による抗体の作成はＷＯ９６／３０４９８中に記載されている。類似のアプローチは、ＥＰ１１４０５９０８Ａ１中に高収率一般発現系として記載されている。]
[0008] 利用可能であるにもかかわらず、これらアプローチは、各宿主細胞中の既知の、必須でない、高度に発現した細胞遺伝子に限定される。さらに、自然相同性組み換えは希有な事象であり、その効率は各部位に依存する。高効率を達成するには大きい相同性配列を使用すべきであり、ここではアイソジェニック配列が最も有効である。したがって、限定された配列情報が入手できる宿主（例えばハムスター）中でのこのアプローチの使用は、その利用性を限定するであろう。]
[0009] 高発現レベルを可能にするゲノム座をランダムに同定するために、レポーター遺伝子及び使用されるリコンビナーゼのために必要とされる認識部位を含有するベクターをこの標的部位で導入することが記載されている（ＷＯ２００４／０２９２８４Ａ３）。レポーター遺伝子がランダムにタグ化された組み込み部位の発現能力の特性決定を可能にする一方で、この認識部位はＧＯＩに対するレポーターの交換を可能にする。]
[0010] Ｐｕｔｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１６（２００５），１４５−１５１）は、細胞株中での標的化した、二重鎖切断媒介した遺伝子組み換えのための方法を開示する。これにより、標的遺伝子を発現する宿主細胞が得られる。このターゲッティングベクターは、単一メガヌクレアーゼ認識部位を含有する。２．５×１０-6（１０クローン／２×１０7細胞、２０％のトランスフェクション効率を有する）という低いターゲッティング効率が報告されている。このようにして、この文献は、高生産性宿主細胞を獲得するための信頼性のある方法を提供しない。]
[0011] ＷＯ２００４／０２９２８４は、ＦＬＰリコンビナーゼにより触媒作用された部位特異的組み換えを使用する生産者宿主細胞の作成のための方法を記載する。この生じる発現細胞株は、ＦＬＰリコンビナーゼ認識部位を未だ含有し、時にこれは興味のある遺伝子の導入後のコード配列内である。これは、生産者細胞株の減少した安定性を生じる。この文献はまた、代替的な組み換え認識部位としてグループＩＩイントロンも示唆するが、このための実験的証拠を開示しない。メガヌクレアーゼ認識部位グループＩイントロンコードするホーミングエンドヌクレアーゼは開示されない。]
[0012] Ｓｏｒｒｅｌ＆ＫｏＩｂ（Ｂｉｏｔｅｃｈ．ＡＤＶ ２３（２００５），４３１−４６９）は、メガヌクレアーゼＩ−Ｓｃｅ−ｌのための単一認識部位を有するターゲッティングベクターを使用する相同性組み換えによる哺乳類ゲノムの部位特異的改変を説明する。ターゲット／置換ベクターの組み込みは標的化した相同性組み換えを介して行われ、ランダム組み換えを介しては行われない。]
[0013] Ｂｅｌｆｏｒｔ ＆ Ｒｏｂｅｒｔｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５（１９９７），３３７９−３３８８）は、グループＩ及びグループＩＩイントロンコード分子を含むホーミングエンドヌクレアーゼを説明する。]
[0014] これら全てのアプローチを用いると交換反応の効率は使用されるリコンビナーゼの効率に依存する。さらに、このランダムに選択された座は良好な転写活性を有する可能性があるが、これは使用されるリコンビナーゼによる効率的な組み換えを支持しない可能性がある。適した組み込み座を同定するためにこのアプローチは更なるスクリーニング労力を必要とする。この種のリコンビナーゼの使用における更なる可能性のある障害は、所望される宿主細胞のゲノム内の偽認識部位（pseudo-recoginition sites）の存在である。この偽認識部位は、必要とされない組み換え事象を生じる可能性がある。これは、この系の効率を減少させ、かつ、必要とされないフェノタイプを有する遺伝子改変された可能性のある細胞を生じるものである。やはり、最も適した細胞を同定するためのスクリーニングを実施する必要がある。このアプローチが機能的と考えられるにもかかわらず、高効率生産細胞の作成におけるその効率及び普遍的な利用性は低いものである。]
[0015] まとめると、組み換えタンパク質の大規模生産のために証明された能力を有する高効率真核生産細胞株の作成のための、迅速で、効率的で、かつ普遍的な系に対する必要性が未だ存在する。]
[0016] 本発明は、この要求を満たすための方法及び材料を開示する。]
[0017] ３．発明の要約
本発明は、前もって形成されかつ特徴付けられた宿主細胞株（ワイルドカード（wild card）細胞）中にＧＯＩを含む発現カセットを部位特異的に導入することを伴う、バイオ医薬品の製造のための高効率真核細胞株の作成のためのワイルドカード戦略に関する方法及び材料を記載する。ワイルドカード細胞は、動的培養系における大規模生産のために必要な特性について選択されている。これは、出発細胞株のゲノム中へのタグ化されたレポーターカセットのランダムな導入及び組み込み部位の発現能力の特性決定（characterise）により作成される。興味のある遺伝子（ＧＯＩ）に対してレポーターを交換することにより、所望される遺伝子産物を効率的に発現することができる生産者細胞株が得られる。]
[0018] ＧＯＩのための供給源として交換ベクターが使用され、これは自体ではＧＯＩの強力な発現を可能にせず、かつ有利にはトランスフェクションされた細胞への選択可能な特性を付与しない。]
[0019] 記載された系とは異なり、このワイルドカード戦略は、発現カセットの媒介された交換のためにリコンビナーゼを使用しない。第１のリポーター遺伝子及び選択マーカーの交換は二重鎖切断（ＤＳＢ）により誘発される相同性組み換えにより媒介される。ＤＳＢを所望されるゲノム性部位で誘発するために、この標的化された座は特定のタグとして、希有ＤＳＢ媒介酵素のための１又は２の認識部位を含有し、これは例えば希有切断メガヌクレアーゼ又はホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）、例えばＩ−Ｓｃｅｌである。ＨＥは細胞中に導入され、定義された部位で認識部位の制限を付与する。ＤＳＢ切断の修復は細胞の内因性修復機構により高頻度に実施される。このパラレルにトランスフェクションされた交換ベクターは、交換されたカセットの隣接領域に対して相同性の配列のために修復マトリックスとして機能する。]
[0020] この種の新規宿主細胞は、組み換え遺伝子産物、特に組み換えタンパク質のための再現性のある、高効率生産細胞株を獲得するために、短期間で予め決定されたゲノム性発現ホットスポット中へのＧＯＩのクローニングを容易にする。]
[0021] この方法は以下の工程を含む：
・選択可能マーカー、定量化可能なレポーター遺伝子及び媒介するＤＳＢ誘発された相同性組み換えのための認識部位を含有するターゲットベクターのランダムな組み込み、
・レポーター遺伝子により判断される通りの、転写活性のある座でのターゲットベクターの単一の組み込まれたコピーを優先的に有する普遍的な宿主細胞株（「ワイルドカード」細胞）の選択、
・レポーター遺伝子及び興味のある遺伝子（ＧＯＩ）に対する第１の選択可能なマーカーの交換及び引き続き、修復マトリックスとして必要とされるエレメントを有する交換ベクターを伴うＤＳＢ誘発された相同性組み換えによる少なくとも１つの更なる選択可能なマーカーの作成。]
[0022] この普遍的なワイルドカード宿主細胞中での交換プロセスは他のＧＯＩｓについて実施することもでき、かつ、毎回、予期可能な、高い発現レベル、生産物（例えばグルコシル化）の品質及び遺伝子産物、例えばタンパク質の大規模生産を可能にする成長特性を有する生産細胞を提供する。]
[0023] この方法は優先的には、任意の組み換えタンパク質の製造を可能にする。この生産されたタンパク質は、酵素、特にプロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、ホルモン、サイトカイン、膜貫通性の又は細胞内のドメインあり及び無しのレセプター（特に膜結合型又は溶解性）、完全長抗体又は抗体ドメインであることができる。特にこの生産されたタンパク質は、前述のタンパク質の部分又はドメインを組み合わせる融合タンパク質に似ていることができる。]
[0024] したがって、本系は、バイオ医薬品の効率的かつ経済的製造のために必要な高生産者細胞の作成を可能にする。]
[0025] これは以下の更なる利点を提供する：
・時間の節約：安定な生産細胞株が、前もって作成したワイルドカード細胞株で開始して数週間内に得られることができる、
・前もって同定した発現ホットスポット中への組み込みにより、この生産細胞株の発現レベルはより信頼性をもって予期可能であり、かつ、異なるＧＯＩｓについて再現可能に達成できる。
・高効率、というのはＧＯＩを発現する細胞だけが交換後に得られるからである、
・部位特異的組み込みの間の可欠ベクター配列の付加的な組み込みなし、
・数ヶ月の間にコンセプト実験の証明のための材料の製造ができる。後の発達相での生産物品質に変化はないものであり、というのは同種かつ遺伝子的に同一の細胞集団が極めて初期から入手できるものであるからである。]
[0026] このようにして、本発明の第１の観点は、以下工程を含む組み換え遺伝子産物、特にポリペプチドの生産のための生産者細胞の作成のための方法である：
（ａ）以下のものを含むターゲットベクターを提供する工程
（ｉ）第１の発現コントロール配列（Ｐ１）に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（ＲＧ１）、
（ｉｉ）第２の発現コントロール配列（Ｐ２）に作動可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）、
（ｉｉｉ）発現コントロール配列に対する作動可能な連結なしの第２の非機能性選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）、
その際、配列（ｉ）は５′位に存在し、配列（ｉｉ）は（ｉ）と（ｉｉｉ）との間に存在し、配列（ｉｉｉ）は３′位に存在する、
（ｉｖ）二重鎖切断媒介酵素のための第１の及び第２の認識部位、その際第１の認識部位は第１の発現コントロ−ル配列（Ｐ１）と第１のレポーター遺伝子（ＲＧ１）との間に存在し、第２の認識部位は配列（ｉｉ）と配列（ｉｉｉ）との間に存在する、
（ｂ）ターゲットベクターを宿主細胞中に、宿主細胞のゲノム中へのターゲットベクターのランダムな組み込みを可能にする条件下で導入する工程、
（ｃ）安定に組み込まれたターゲットベクターを有し、かつ、転写活性、有利にはＲＧ１の高くかつ安定な転写活性を示す宿主細胞を選択する工程、
（ｄ）以下のものを含有する交換ベクターを提供する工程、
（ｉ）興味のある遺伝子（ＧＯＩ）及び
（ｉｉ）第３の発現コントロ−ル配列（Ｐ３）に作動可能に連結された不活性な第２の選択マーカー遺伝子（ΔＳＭ２）、
その際、交換ベクターは、第１の５′−相同性配列と第２の３′−相同性配列とを含有し、これはターゲットベクターの配列との組み換えを可能にする、
（ｅ）第１の及び／又は第２の認識部位での、有利には（ａ）（ｉｖ）で定義された第１の及び第２の認識部位での二重鎖切断及び二重鎖切断媒介相同性組み換えによる宿主細胞のゲノム中への交換ベクターの組み込みを可能にする条件下で、工程（ｃ）で得られた宿主細胞中に交換ベクターを導入する工程、
これにより、この不活性な第２の選択マーカー遺伝子（ΔＳＭ２）は交換ベクターの組み込みにより活性化される、
（ｆ）組み込まれたターゲットベクターとの相同性組み換えによる組み込まれた交換ベクターを有する生産者細胞を選択する工程、その際、生産者細胞はＧＯＩを発現する。]
[0027] 本発明の更なる観点は、組み換え遺伝子産物の大規模生産のために適した高収率生産細胞株の迅速な製造を可能にする普遍的宿主細胞（ワイルドカード細胞）を作成するための方法である。この方法は以下を含む：
（ａ）以下のものを含むターゲットベクターを提供する工程
（ｉ）第１の発現コントロール配列（Ｐ１）に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（ＲＧ１）、
（ｉｉ）第２の発現コントロール配列（Ｐ２）に作動可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）、
（ｉｉｉ）発現コントロール配列に対する作動可能な連結なしの第２の非機能性選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）、
その際、配列（ｉ）は５′位に存在し、配列（ｉｉ）は（ｉ）と（ｉｉｉ）との間に存在し、配列（ｉｉｉ）は３′位に存在する、
（ｉｖ）二重鎖切断媒介酵素、特にメガヌクレアーゼのための第１の及び第２の認識部位、その際第１の認識部位は第１の発現コントロ−ル配列（Ｐ１）と第１のレポーター遺伝子（ＲＧ１）との間に存在し、第２の認識部位は配列（ｉｉ）と配列（ｉｉｉ）との間に存在する、
（ｂ）ターゲットベクターを宿主細胞中に、宿主細胞のゲノム中へのターゲットベクターのランダムな組み込みを可能にする条件下で導入する工程、及び
（ｃ）安定に組み込まれたターゲットベクターを有し、かつ、ＲＧ１の転写活性を示す宿主細胞を選択する工程。]
[0028] 本発明の更なる観点は、組み換え遺伝子産物の製造方法であり、以下の工程を含む：
（ａ）以下のものを含む発現カセットをそのゲノム中に組み込んで有するワイルドカード宿主細胞を提供する工程
（ｉ）第１の発現コントロール配列（Ｐ１）に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（ＲＧ１）、
（ｉｉ）第２の発現コントロール配列（Ｐ２）に作動可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）、
（ｉｉｉ）発現コントロール配列に対する作動可能な連結なしの第２の非機能性選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）、
その際、配列（ｉ）は５′位に存在し、配列（ｉｉ）は（ｉ）と（ｉｉｉ）との間に存在し、配列（ｉｉｉ）は３′位に存在する、
（ｉｖ）二重鎖切断媒介酵素のための第１の及び第２の認識部位、その際第１の認識部位は第１の発現コントロ−ル配列（Ｐ１）と第１のレポーター遺伝子（ＲＧ１）との間に存在し、第２の認識部位は配列（ｉｉ）と配列（ｉｉｉ）との間に存在する、
その際発現カセットは宿主細胞ゲノム中に安定に組み込まれており、かつ、レポーター遺伝子（ＲＧ１）の転写活性を示す、
（ｂ）以下のものを含有する交換ベクターを提供する工程、
興味のある遺伝子（ＧＯＩ）及び
第３の発現コントロ−ル配列（Ｐ３）に作動可能に連結された（operatively linked）不活性な第２の選択マーカー遺伝子（ΔＳＭ２）、
その際、交換ベクターは、第１の５′−相同性配列と第２の３′−相同性配列とを含有し、これはターゲットベクターの配列との組み換えを可能にする、
（ｃ）第１の及び／又は第２の認識部位での、有利には（ａ）（ｉｖ）で定義された第１の及び第２の認識部位での二重鎖切断及び二重鎖切断媒介相同性組み換えによる宿主細胞のゲノム中への交換ベクターの組み込みを可能にする条件下で、工程（ｃ）で得られた宿主細胞中に交換ベクターを導入する工程、
これにより、この不活性な第２の選択マーカー遺伝子（ΔＳＭ２）は交換ベクターの組み込みにより活性化される、
（ｄ）組み込まれたターゲットベクターとの相同性組み換えによる組み込まれた交換ベクターを有する生産者を選択する工程、その際、生産者細胞はＧＯＩを発現する。]
[0029] 本発明の更なる観点は、組み換え遺伝子産物の生産のための生産者宿主細胞の作成のための方法であって、以下工程を含む：
（ａ）転写活性を支持する宿主細胞のゲノムの部位中に標的化した相同性組み換えにより二重鎖切断媒介酵素のための第１の及び第２の認識部位を含有する核酸配列を導入する工程、
（ｂ）安定に組み込まれた第１の及び第２の認識部位を有するワイルドカード宿主細胞を選択する工程、
（ｃ）以下のものを含有する交換ベクターを提供する工程、
（ｉ）興味のある遺伝子（ＧＯＩ）及び
（ｉｉ）第１の５′−相同性配列及び第２の３′−相同性配列、これにより第１の及び／又は第２の組み込み部位の組み込み部位での配列との組み換えが可能になる、
（ｄ）（ａ）で定義された第１の及び／又は第２の認識部位での二重鎖切断及び二重鎖切断媒介相同性組み換えによる宿主細胞のゲノム中への交換ベクターの組み込みを可能にする条件下で、工程（ｂ）で得られた宿主細胞中に交換ベクターを導入する工程、及び
（ｅ）相同性組み換えによる組み込まれた交換ベクターを有する生産者を選択する工程、その際、生産者細胞はＧＯＩを発現する。]
[0030] 本発明の更なる観点は、興味のある遺伝子（ＧＯＩ）の導入のためのワイルドカード宿主細胞の製造のための方法であって、以下工程を含む：
（ａ）転写活性を支持する宿主細胞のゲノムの部位中に標的化した相同性組み換えにより二重鎖切断媒介酵素のための第１の及び第２の認識部位を含有する核酸配列を導入する工程、
（ｂ）安定に組み込まれた第１の及び第２の認識部位を有するワイルドカード宿主細胞を選択する工程。]
[0031] 本発明の更なる観点は、組み換え遺伝子産物の製造方法である：
（ａ）二重鎖切断媒介酵素のための第１の及び第２の認識部位を含有する核酸配列をそのゲノム中に組み込んで有するワイルドカード宿主細胞を提供する工程、
その際核酸配列は転写活性を支持する部位で宿主細胞ゲノム中に安定に組み込まれている、
（ｂ）以下のものを含有する交換ベクターを提供する工程、
（ｉ）興味のある遺伝子（ＧＯＩ）及び
（ｉｉ）第１の５′−相同性配列及び第２の３′−相同性配列、これにより第１の及び／又は第２の組み込み部位の組み込み部位での配列との組み換えが可能になる、
（ｃ）（ａ）で定義された第１の及び／又は第２の認識部位での二重鎖切断及び二重鎖切断媒介相同性組み換えによる宿主細胞のゲノム中への交換ベクターの組み込みを可能にする条件下で、工程（ａ）で提供された宿主細胞中に交換ベクターを導入する工程、
（ｄ）相同性組み換えによる組み込まれた交換ベクターを有する生産者を選択する工程、その際、生産者細胞はＧＯＩを発現する。]
[0032] 本発明の更なる観点は、以下の物を含むターゲットベクターである：
（ａ）第１の発現コントロール配列（Ｐ１）に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（ＲＧ１）、
（ｂ）第２の発現コントロール配列（Ｐ２）に作動可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）、
（ｃ）発現コントロール配列に対する作動可能な連結なしの非機能性の第２の選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）、
その際、配列（ｉ）は５′位に存在し、配列（ｉｉ）は（ｉ）と（ｉｉｉ）との間に存在し、配列（ｉｉｉ）は３′位に存在し、
二重鎖切断媒介酵素、特にメガヌクレアーゼのための第１の及び第２の認識部位、その際第１の認識部位は第１の発現コントロ−ル配列（Ｐ１）と第１のレポーター遺伝子（ＲＧ１）との間に存在し、第２の認識部位は配列（ｉｉ）と配列（ｉｉｉ）との間に存在する。]
[0033] 本発明の更なる観点は、以下のものを含む交換ベクターである：
（ｉ）興味のある遺伝子（ＧＯＩ）及び
（ｉｉ）第３の発現コントロ−ル配列（Ｐ３）に作動可能に連結された不活性な第２の選択マーカー遺伝子（ΔＳＭ２）、
その際、交換ベクターは、第１の５′−相同性配列と第２の３′−相同性配列とを含有し、これは宿主細胞のゲノム中での予め決定された部位との、例えばターゲットベクターの配列との組み換えを可能にする。]
[0034] 本発明の更なる観点は、上述の方法により得られる興味のある遺伝子の導入及び効率的発現のための普遍的ワイルドカード宿主細胞及び記載される方法を使用するこの種のワイルドカード宿主細胞を使用することにより生産される組み換え遺伝子産物の大規模製造のための高効率生産細胞を参照する。]
[0035] ４．発明の詳細な説明
４．１宿主細胞
本発明は生産者又はワイルドカード宿主細胞の作成を言及する。有利には宿主細胞は真核細胞、例えば酵母細胞、真菌細胞又は脊椎動物細胞、例えば昆虫又は哺乳類細胞である。より有利には、宿主細胞は哺乳類細胞、例えば齧歯類細胞、例えばマウス、ラット又はハムスター細胞又は霊長類細胞、例えばヒト細胞である。特に有利な一実施態様において、宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。更に有利な細胞は、ＮＳＯ細胞、ハイブリドーマ、例えばマウス又はマウス／ヒト細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はＰｅｒＣ６細胞である。特別な一実施態様において、宿主細胞は、血清不含条件下で懸濁培地中で高細胞密度で成長可能である。]
[0036] ４．２ベクター系
本発明は、ワイルドカード宿主細胞を獲得するための様々なベクター、すなわち、宿主細胞中にレポーター遺伝子カセットを導入するためのターゲットベクター、及び、生産者細胞を作成するためのワイルドカード宿主細胞中に興味のある遺伝子（ＧＯＩ）を導入するための交換又は組み換えベクターの使用に関する。場合により、宿主細胞中での二重鎖切断媒介酵素の発現のための第３のベクターが使用される。]
[0037] このベクターは、各宿主細胞と相容性であるように選択される。このようにして、ベクターは真核細胞に特に適する。有利にはベクターは、非ウィルス性ベクター、例えば環状又は線状プラスミドベクターである。]
[0038] ４．２．１ターゲットベクター
４．２．１．１ランダム組み込みのためのターゲットベクター
本発明のターゲットベクターは有利にはレポーター遺伝子（ＲＧ１）及び第１の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）を含有する。両方の遺伝子は有利には、バイシストロン性発現カセットを形成し、その際ＲＧ１は第１の発現コントロール配列（Ｐ１）に作動可能に連結されており、かつ、ＳＭ１遺伝子は第２の発現コントロール配列（Ｐ２）に作動可能に連結されている。ＲＧ１は有利にはＳＭ１遺伝子に対する５′に位置する。さらに、ターゲットベクターは非機能性の第２の選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）を含有する。さらに、ターゲットベクターは有利には原核性配列エレメントを実質的に含まない。]
[0039] ＲＧ１は任意のレポーター遺伝子であってよく、これは検出可能な遺伝子産物、例えば酵素又はルミネッセンスの遺伝子産物を発現する。有利には、レポーター遺伝子は、モニタリング及び定量化できる発現をする遺伝子である。レポーター遺伝子の典型例は、アルカリホスファターゼ、例えば分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ又は蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ又はその変形である。]
[0040] ＲＧ１は、第１の発現コントロール配列（Ｐ１）に作動可能に連結されており、これは有利には宿主細胞中でのレポーター遺伝子の発現を駆動できる構成性プロモーターを含有する。一実施態様において、Ｐ１は強力な構成性プロモーターを含有してよく、これは例えばＣＭＶプロモーター（例えば、ヒト又はネズミＣＭＶウィルス由来のエンハンサーを有する前／初期（immediate/early）プロモーター）であり、これは付加的に、例えばＣＭＶイントロンＡで補うことによりエンハンスされていてよく、これにより転写活性及びｍＲＮＡ安定性が増加する。一般的には、真核細胞中で高くかつ構成的な発現を可能にする任意のコントロール配列が使用できる。これら配列は、天然に生じるか又は天然に生じるエレメントの組み合わせであることができる。さらに、合成プロモーターエレメントも使用してよい。さらに、適した第１の発現コントロール配列（Ｐ１）の例は、ヒトの伸長因子１アルファ（ＥＦ−１アルファ）プロモーター（相応する第１のイントロンあり及びなし）、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）ＬＴＲに由来するプロモーター、又はＨＩＶ２ＬＴＲ又はこれらに由来する配列の組み合わせである。]
[0041] 異なる一実施態様において、Ｐ１は減弱化されたプロモーターを含有でき、この強さは、野生型プロモーター、例えば改変されたＣＭＶプロモーターに対して減少されている。プロモーター強度は減少されてよく、例えばイントロンＡ配列の発現促進作用を変更することにより減少されてよい。これは、イントロンの３′−領域中に短鎖の非相同性ヌクレオチド配列（例えば１００ｂｐまで）の組み込みにより行うことができる。この挿入は、交換ベクターとの相同性組み換え後に負に作用しない。交換ベクター中の適した配列の選択により、この減弱化された型のプロモーターは、交換ベクターが宿主細胞ゲノム中に挿入される場合に、完全に活性のある型により交換されてよい。]
[0042] この第１の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）は、宿主細胞中で選択可能なフェノタイプを提供することができる任意の選択マーカー遺伝子であってよい。例えば、ＳＭ１は、抗生物質性耐性遺伝子、例えばネオマイシン又はヒグロマイシン耐性遺伝子であってよい。更に、選択可能なマーカー、例えば、ブラスチシジン、ピューロマイシン、ウワバインに対する耐性を付与する遺伝子又はグルタミン合成酵素遺伝子が使用できる。]
[0043] Ｍ１は、第２の発現コントロール配列（Ｐ２）との作動可能な連結にあり、これは有利には構成性プロモーター、例えばＳＶ−４０プロモーターを含有する。特定の一実施態様において、Ｐ２は減弱化されたプロモーター、すなわち、野生型プロモーターの減弱化された型であるプロモーターを含有してよい。代替的に又は付加的に、ＳＭ１は、野生型選択マーカー遺伝子に比較して減少した活性を有する減弱化選択マーカー遺伝子であってよい。減弱化したプロモーター及び／又は選択マーカー遺伝子の使用により、高転写活性を有する、組み込み部位で組み込まれたターゲットベクターを有する宿主細胞の選択は容易になってよい。]
[0044] 代替的な一実施態様において、ＳＭ１の発現は、ＲＧ１コード領域の３′末端とＳＭ１コード領域の５′末端との間に配置されたＩＲＥＳエレメントの使用により達成される。]
[0045] さらに、ターゲットベクターは典型的にはＲＧ１及びＳＭ１のためのコード領域の３′末端でポリアデニル化シグナルを含有し、これは例えばウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル又はＳＶ−４０ポリアデニル化シグナルである。]
[0046] このターゲットベクターは更に、発現コントロール配列に対する作動性連結なしの第２の非機能的選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）を含有する。ＳＭ２は外側に、有利にはＲＧ１及びＳＭ１のためのバイシストロン性発現カセットの３′側に配置される。特定の一実施態様において、ＳＭ２のためのコード領域はＡＴＧ開始コドン無し及び／又は上流の停止コドンであり、有利には全ての３つのリーディングフレーム中に上流の停止コドンを有する。]
[0047] ＳＭ２は、宿主細胞中の選択可能なフェノタイプを提供することができる任意の選択マーカーであってよい。有利には、ＳＭ２はＳＭ１とは異なる。例えば、ＳＭ２は、抗生物質耐性遺伝子、例えばネオマイシン又はヒグロマイシン耐性遺伝子であってよい。更なる例としては、ブラスチシジン、ピューロマイシン、ウワバインに対する耐性を付与する遺伝子又はグルタミン合成酵素遺伝子である。]
[0048] 特異的な二重鎖切断をターゲットベクター内で誘導するためには、これは二重鎖切断媒介酵素、特にメガヌクレアーゼのための第１の及び第２の認識部位を含有する。この第１の認識部位は、Ｐ１とＲＧ１のコード配列との間に存在し、この第２の認識部位はＳＭ１のためのコード配列と非機能性配列ＳＭ２との間に存在する。２つの認識部位により隣接されるこの部分のターゲットベクターは、交換領域と呼称されてよい。]
[0049] 特定の一実施態様において、第２の認識部位はＳＭ１の停止コドンと引き続くポリアデニル化シグナルとの間に位置してよい（ターゲットベクターＡ）。更なる一実施態様において、第２の認識部位はＳＭ１ポリアデニル化シグナルとＳＭ２のコード領域の開始部との間に位置してよい（ターゲットベクターＢ）。]
[0050] この２つの認識部位は、同じ配向又は相互に反対の配向を有してよい。有利な一実施態様において、野生型の下流エクソンに相当する認識部位の部分は、切除後の交換領域の外側に位置する。]
[0051] 二重鎖切断媒介酵素は、有利にはメガヌクレアーゼ又はホーミングヌクレアーゼであり、これは宿主細胞ゲノム中で希有に生じる認識部位を有し、例えばグループＩイントロンをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ（a group I intron encoded homing nuclease）である。有利には、メガヌクレアーゼ又はホーミングヌクレアーゼは、宿主細胞ゲノム内では天然に生じない認識部位を有する。認識部位は典型的には少なくとも１０個、有利には少なくとも１２個のヌクレオチド長さを有する。より有利には、ヌクレアーゼは１８ヌクレオチドの認識部位を有し、このためエンドヌクレアーゼのドデカペプチドファミリーに属する。この種の酵素の例はＵＳ２００５／００３２２２３中に説明され、この内容は参照することにより本願に組み込まれる。有利にはメガヌクレアーゼは、Ｉ−Ｓｃｅｌ、Ｉ−Ｓｃｅｌｌ、Ｉ−Ｓｃｅｌｌｌ、Ｉ−ＳｃｅｌＶ、Ｉ−Ｃｅｕｌ、Ｉ−Ｃｒｅｌ、Ｉ−Ｐｐｏｌ、Ｉ−Ｔｅｖｌ、Ｉ−Ｔｅｖｌｌ、Ｉ−Ｔｅｖｌｌｌ、Ｈｏ及びＥｎｄｏＳｃｅｌから選択される。より有利には、このメガヌクレアーゼはＩ−Ｓｃｅｌである。]
[0052] 本発明のターゲットベクターの２個の実施態様は図１（ターゲットベクターＡ）及び２（ターゲットベクターＢ）中に示されている。このレポーター遺伝子はイントロンＡを含むエンハンスされたＣＭＶプロモーター（ｅＣＭＶ）に作動可能に連結されている。この最初の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）は、ＳＶ４０プロモーター（Ｐｓｖ４０）に作動可能に連結されている。この第２の選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）はプロモーターに作動可能に連結されておらず、このため非機能性である。] 図１
[0053] ４．２．１．２非ランダム組み込みのためのターゲットベクター
本発明の異なる一実施態様において、ターゲットベクターは付加的に第１の５′−及び第２の３′−相同性配列を含んでよく、これは上述の通りのターゲットベクターの遺伝子エレメントに隣接し、かつ、宿主細胞の予め定められた遺伝子座で、すなわち、転写活性を支持することが知られている遺伝子座、例えば免疫グロブリン座で、非ランダムな相同性組み換えを可能にする。この実施態様において、レポーター遺伝子は上述の通り発現コントロール配列に作動可能に連結されているか、又は代替的に、発現コントロール配列を欠失していてよく、これは、この隣接する相同性配列が、内因性発現コントロール配列との作動性連結においてレポーター遺伝子（ＲＧ１）を配置する位置での相同性組み換えを可能にすべく選択される場合である。]
[0054] 代替的に、この実施態様のためにはレポーター遺伝子を欠失するターゲットベクターを使用してよい。]
[0055] ４．２．２交換ベクター
交換ベクターは有利には、興味のある遺伝子（ＧＯＩ）、及び、不活性の、例えば不完全な、第２の選択マーカー遺伝子のためのコード配列（ΔＳＭ２）を含有する。興味のある遺伝子は、所望の遺伝子産物、特に組み換えタンパク質をコードする任意の遺伝子であってよく、しかしまた、組み換え核酸、例えば所望されるＲＮＡ分子であってもよい。有利には、ＧＯＩは機能性発現コントロール配列なしで存在する。より有利には、このＧＯＩはその５′−末端に部分的な発現コントロール配列を含有し、これはターゲットベクター中で第１の発現コントロール配列（Ｐ１）の第３′−プライム部と同一又は実質的に同一である。さらに、ＧＯＩのための適したポリアデニル化シグナルが、ターゲットベクターのために説明された通りコード配列の３′末端に位置していることが有利である。]
[0056] ＳＭ２のための不活性なコード配列は、機能性選択マーカーの作成を可能にしない。この目的のために、典型的には、ＳＭ２のコード配列の３′部分は、交換ベクター中で欠失していてよい。しかしながら、ＳＭ２のための不活性なコード配列は、機能性発現コントロール配列、例えば、構成性プロモーター、例えばＳＶ４０プロモーターに対する作動性連結にある。]
[0057] 更なる一実施態様において、交換ベクターは付加的に第３の選択マーカー遺伝子（ＳＭ３）を含有し、これはＧＯＩと同時転写される。この目的のために、ＩＲＥＳエレメントに作動可能に連結されたＳＭ３のためのコード配列は、ＧＯＩのためのコード配列の３′末端とポリアデニル化部位との間に配置されてよい。代替的に、ＧＯＩとＳＭ３の順序は交換されてもよい。更なる一実施態様において、ＧＯＩ及びＳＭ３は、別個の発現コントロールエレメント（プロモーター）を有する独立した発現カセットから発現される。ＳＭ３はＳＭ２とは異なり、かつ、ＳＭ２とは独立して細胞の選択を可能にする。このようにして、二重選択により両方の選択マーカーを発現する細胞の濃縮が可能になる。両方の選択マーカーは、限定されることなく、ヒグロマイシン、ネオマイシン、Ｇ４１８、ブラスチシジン、ピューロマイシン、ウワバインに対する耐性を付与する遺伝子又はグルタミン合成酵素遺伝子から選択されてよい。]
[0058] ＧＯＩの部分的なプロモーター配列５′の長さと不完全なＳＭ２の長さは、ターゲットベクター上でそれぞれの相同性エレメント間で効率的な相同性組み換えが可能であるように選択される。]
[0059] さらに、交換ベクターは、第１の５′−相同性配列及び第２の３′−相同性配列を含有し、これはターゲットベクターの配列との組み換えを可能にする。それぞれの相同性配列の長さは有利には少なくとも約５００ヌクレオチド、より有利には少なくとも７００ヌクレオチドである。特別に有利な一実施態様において、この５′−相同性配列は少なくとも約１０００ヌクレオチドの長さを有し、かつ、この３′−相同性配列は少なくとも約７００ヌクレオチドの長さを有する。この相同性配列の最大の長さは有利には約２０００ヌクレオチドである。このターゲット及び交換ベクター上の相同性配列間の同一性の程度は全配列に対して有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも９０％である。最も有利にはこの相同性配列は、最大の交換率を獲得するために実質的に同一である。さらに、発現ベクター中のこの５′−相同性配列が機能性プロモーターを含有しないことが有利である。交換ベクター中のこの３′−相同性配列は有利には機能性選択マーカー配列を含有しない。]
[0060] 付加的に交換ベクターは、第１の５′−及び第２の３′−相同性配列により定義される配列領域の外側に第４の選択マーカー遺伝子を含有してよい。この第４の選択マーカー遺伝子はネガティブ選択マーカー遺伝子、例えば自殺遺伝子、例えばＨＳＶ−チミジンキナーゼであり、これは、ネガティブ選択マーカー遺伝子をやはり組み込む宿主細胞ゲノム中への交換ベクターの任意のランダムな組み込みに対する選択を可能にする。]
[0061] 交換ベクターの２つの実施態様は図３（交換ベクターＡ）及び図４（交換ベクターＢ）に示されている。興味のある遺伝子（ＧＯＩ）は、５′−削除した部分的なｅＣＭＶプロモーター（ΔＣＭＶ）に対して作動可能に連結されている。この第２の選択マーカー（ＳＭ２）は、ＳＶ４０プロモーター（Ｐｓｖ４０）に対して作動可能に連結されている。ターゲットベクターを有する相同性配列は点線により示される。交換ベクターＢ（図４）は付加的に、相同性配列の外側の自殺遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）及びＩＲＥＳエレメントに対して作動可能に連結されたＧＯＩ遺伝子（ＳＭ３）と同時伝達される第３の選択マーカーを含有する。] 図３ 図４
[0062] 代替的な一実施態様において、交換ベクターは、不活性な第２の選択マーカー遺伝子の代わりに発現コントロール配列に対して作動可能に連結された活性のある第２の選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）を含有してよい。]
[0063] ４．３ワイルドカード細胞株の作成
４．３．１ランダム組み込み
ワイルドカード宿主細胞を作成するためには、セクション４．２．１．１で上述したターゲットベクターを、非相同性の、すなわち、ランダムな組み換えにより、宿主細胞のゲノム中にターゲットベクターのランダムな組み込みを可能にする条件下で宿主細胞中に導入してよい。]
[0064] 特定の一実施態様において、ターゲットベクターはトランスフェクション前に必要とされない細菌性エレメントが取り除かれている。これは、細菌性ＤＮＡエレメントにより媒介される遺伝子サイレンス化作用（silencing effect）を除去するものである。]
[0065] トランスフェクションのための条件は優先的に単一組み込み部位のみがタグ化されるように選択される。さらに、ターゲットベクターの単一コピーの組み込みが好まれる。]
[0066] 安定にトランスフェクションした宿主細胞の選択はＳＭ１の使用により容易になり、これは典型的には抗生物質耐性遺伝子、例えばネオマイシン又はヒグロマイシン耐性遺伝子である。このようにして、選択手順は有利には、ＳＭ１が媒介する耐性に対する抗生物質の存在下でのトランスフェクションされた細胞の成長を含む。]
[0067] 次工程においては、組み込まれたターゲットベクターを有し、かつ、レポーター遺伝子（ＲＧ１）の高発現を示す宿主細胞が選択される。有利には、オリゴクローン細胞集団に対するクローンがこの目的のために限定された希釈戦略により作成される。有利には、この工程は懸濁物中での成長に適合させた宿主細胞を使用して血清不含培養条件下で実施される。]
[0068] この選択手順の有利な一実施態様において、トランスフェクションされた細胞は、優先的に１〜５細胞に由来する細胞集団中での選択後に生じる密度で播種される。クローン又はオリゴクローン細胞集団は増大し、ランダムにタグ化されたゲノム座の転写能力はレポーター遺伝子（ＲＧ１）により分析される。有利には、ＲＧ１発現の定量分析が実施される。]
[0069] ＲＧ１の発現されたレベルに基づいて高生産クローンが選択される。単一細胞由来の宿主細胞集団を可能性のあるワイルドカード細胞株として導くために、第２の限定された希釈クローニングが有利に実施される。更なる有利な一工程において、細胞はその成長特性に応じて選択され、特に有利な細胞は、低い二倍化時間に応じた迅速な成長を、特に血清不含培養条件下で示す。]
[0070] 有利な一実施態様において、選択手順は以下の工程を伴ってよい：
（ｉ）組み込まれたターゲットベクターを有する宿主細胞から、高くかつ安定な発現のレポーター遺伝子（ＲＧ１）を有するものを選択する工程、
（ｉｉ）（ｉ）で得られた細胞から、このフェノタイプが工業的な培養条件（すなわち、動的培養系、例えばスピナー、撹拌タンク、波反応器、流動層反応器又は固定層反応器）下での効率的な大規模培養を可能にするものを選択する工程、及び
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた細胞から、興味のある遺伝子のための発現カセットに対するレポーターカセットの効率的な交換を可能にするものを選択する工程。]
[0071] 十分な生産能力を有する適した「ワイルドカード」−細胞株の選択は、分泌されるレポーター、例えばヒトの胎盤から分泌されるアルカリホスファターゼ（ｈＳＥＡＰ）又は適した他の定量化可能なレポータータンパク質の活性についてのスクリーニングにより実施されてよい。単一細胞由来の宿主細胞集団を可能性のあるワイルドカード細胞株として導くためには、第２の限定された希釈クローニングが有利には実施される。]
[0072] 更なる一実施態様において、高発現ワイルドカード宿主細胞の選択は蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその変形、すなわち、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）又はその他の変形を用いて実施されてもよい。発現されたレポーターにより、高発現を有する細胞は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は適したラベル化後に磁性濃縮（magnetic enrichment）（ＭＡＣＳ又は類似技術）によりトランスフェクションされた細胞のプールから濃縮されることができる。幾つかの引き続く濃縮サイクルにより、各レポーターについて高発現を有する集団が得ることができる。最終的なワイルドカード細胞は、有利にはこれら濃縮されたポリクローナル細胞集団の限定された希釈クローニングによっても作成される。]
[0073] レポーター遺伝子の更なる有利な例は、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコニダーゼ、ルシフェラーゼその他である。]
[0074] 特に有利な一実施態様において、「アウトパフォーマー（outperformer）」ワイルドカード細胞株が選択され、これは生じる集団のクローンの平均的な発現レベルに比較して有利には少なくとも１０倍、より有利には少なくとも２０倍、更により有利には少なくとも２５倍であるレポーター遺伝子発現レベルを有する。]
[0075] 更なる有利な一実施態様において、少なくとも１０００、例えば少なくとも２０００、又は少なくとも３０００のプライマリークローン又はオリゴクローン細胞集団が、高発現するワイルドカード宿主細胞株、例えばアウトパフォーマーワイルドカード宿主細胞株を同定するために分析される。]
[0076] 有利なワイルドカード細胞株は、高度に転写活性のある部位においてターゲットベクターの単一コピーを組み込んで有する。適したワイルドカード細胞の選択のためには、組み込み部位の数及びターゲットベクターの組み込まれたコピー数が優先的に考慮される。組み込まれたターゲットベクターの数及び組み込み部位の数の分析は、ＰＣＲ（優先的にはリアルタイム定量ＰＣＲ）及びサザンブロット分析又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより実施できる。]
[0077] 更なる一実施態様において、最終的なワイルドカード宿主細胞は、安定に組み込まれたターゲットベクターの他に、交換反応の間に使用される二重鎖切断（ＤＳＢ）媒介酵素のための発現カセットを収容してよい。この発現カセットは、ターゲットベクターの一部であることができるか又は別個のベクターとして導入されることができる。この発現カセットは優先的には、ＤＳＢ媒介酵素の時間制御された発現を達成するために誘導可能なプロモーターを含有する。]
[0078] ４．３．２非ランダム組み込み
異なる一実施態様において、ＤＳＢ媒介酵素のための第１の及び第２の認識部位は宿主細胞ゲノムの予め定められた部位に対する標的化した相同性組み換えにより誘導されてよく、この部位は転写活性を支持することが知られており、例えば免疫グロブリン座である。この目的のためには、有利には、セクション４．２．１．２において説明された通りの非ランダム組み込みのためのターゲットベクターが使用される。選択手順はセクション４．３．１において説明されたように実施されてよい。]
[0079] しかしながら、選択手順はこの実施態様の幾つかの変形においては必要とされないことに留意すべきであり、というのは、認識部位は転写活性を支持することが知られている予め定められた部位で導入されるからである。]
[0080] ４．４ワイルドカード細胞内での発現カセットの交換
発現カセットの交換のためには、上述の通りの交換ベクターがワイルドカード宿主細胞、すなわち、宿主細胞ゲノム中のターゲットベクターのランダム又は非ランダム組み込みにより得られるワイルドカード宿主細胞中に、ターゲットベクター上に存在する第１の及び／又は第２の認識部位での二重鎖切断を可能にする条件下で導入される。これにより、二重鎖切断媒介相同性組み込みによる宿主細胞のゲノム中への交換ベクターの組み込みが達成される。]
[0081] この目的のために、ワイルドカード宿主細胞は有利には上述の通りの交換ベクター及び更なるメガヌクレアーゼ発現ベクターと同時トランスフェクションされ、これは特に、ターゲットベクター中に存在する認識部位と相容性であるホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）、例えばＩ−Ｓｃｅｌである。代替的に、この二重鎖切断媒介酵素は、所望される酵素をコードする適したｍＲＮＡとのトランスフェクション後に、又は、細胞に対するこの酵素の直接的配送により、宿主細胞中で発現されてよい。]
[0082] この酵素は認識部位をターゲットベクター内で切除するものである。切除部位の数に依存して、これは単にゲノム中に組み込まれたターゲットベクターを開くか（１の認識部位）、又は、ターゲットベクターから交換可能な発現カセットを放出する（発現カセットに隣接する２の認識部位）。両方の場合に、ＨＥの活性は二重鎖切断（ＤＳＢ）の発生をターゲットベクター内の定義された位置でのワイルドカード細胞のゲノム内で生じるものである。]
[0083] このＤＳＢは相同性組み換え（ＨＲ）を、内因性ＨＲについて観察されるのに比較して１００〜１０００より高い頻度でもって誘発するものである。この修復プロセス内では、トランスフェクションされた交換ベクターは修復マトリックスとして機能し、その相同性配列のために隣接する発現カセットを伸長する。]
[0084] 結果としてＲＧ１及びＳＭ１を有する完全な発現カセットがワイルドカード細胞のゲノムから除去され、かつ、ＧＯＩ及び特定の実施態様において更にＳＭ３（例えばＧＯＩに対してＩＲＥＳを介してカップリングされている）を含有する発現カセットにより置換される。]
[0085] ＳＭ３は、ＧＯＩの発現を分析する必要性なしにＧＯＩ及びＳＭ３を有する発現カセットを転写する細胞の更なる選択を可能にする。]
[0086] ＨＲの更なる重要な結果は、ターゲットベクター中でのプロモーターのないＳＭ２の活性化である。交換ベクターと一緒でのＨＲのためにＳＭ２は、プロモーターが補われ、このようにして成功した修復されたワイルドカード細胞内でのＳＭ２の発現を容易にする。]
[0087] プロモーターは、発現ベクター中で短縮化された型のΔＳＭに対してのみ作動可能に連結しているので、細胞に対する耐性を提供しない。相同性組み換え後にＳＭ２は活性化され、交換ベクターから発現カセットを導入することにより成功して修復された二重鎖切断を有する細胞の効率的な選択が可能になる。]
[0088] この単一（ＳＭ２を使用する）又は二重（ＳＭ２及びＳＭ３を使用する）の選択のために、過剰なスクリーニングの必要性なしに、ＧＯのための高発現レベルでもって同種の生産者細胞集団が作成できる。]
[0089] ワイルドカード細胞のゲノム改変はタグ化された座での発現カセットの交換に限定されているので、この細胞のフェノタイプは影響を受けない。]
[0090] 単一細胞由来の細胞集団が必要とされる場合すら、これは短期間で得ることができ、というのはこの選択後に得られる集団の限定された希釈は高い率の成功でもって容易になされるからである。]
[0091] このようにして、本発明は、所望される組み換え遺伝子産物、例えば組み換えタンパク質又は核酸を大量で得るための生産者宿主細胞を作成するための迅速かつ再現性のある方法を提供する。]
[0092] 相同性組み換えによるターゲットと交換ベクターとの間での交換反応の２つのスキームが図５及び６に示されている。] 図５
[0093] 異なる一実施態様において、交換ベクターはワイルドカード宿主細胞のゲノム中に導入されてよく、これは、第１の及び／又は第２のＤＳＢ媒介酵素認識部位のそのゲノムの予め定められた座での非ランダム組み込みにより、有利にはセクション４．２．１．２で説明した通りのターゲットベクターにより得られる。 この実施態様において、交換ベクターは有利には以下のものを有する：
（ｉ）興味のある遺伝子（ＧＯＩ）及び
（ｉｉ）第１の５′−相同性配列及び第２の３′−相同性配列、これにより第１の及び／又は第２の組み込み部位の組み込み部位での配列との組み換えが可能になる、
より有利にはセクション４．２．２において説明した通りの交換ベクターが使用される。]
[0094] さらに、本発明は以下の図面及び実施例によりより詳細に説明される。]
[0095] 図面
図１ターゲットベクター（ターゲットベクターＡ）の実施態様中の遺伝子エレメントの図式
このターゲットベクターは、ＣＭＶ−プロモーター（Ｐ１）駆動されるレポーター遺伝子（ＲＧ１）及びＰＳＶ４０（Ｐ２）により駆動される第１の選択マーカー（ＳＭ１）を宿主細胞のゲノム中のベクターの安定な組み込みの選択のために有する発現カセットを含有する。この交換カセットは、ホーミングエンドヌクレアーゼ（Ｉ−Ｓｃｅｌ）のための２つの認識部位により隣接されている。発現カセットの外側のこの第２の選択マーカー（ＳＭ２）はプロモーターなしであり、このようにしてターゲットベクター中で非機能性である。] 図１
[0096] 図２ターゲットベクター（ターゲットベクターＢ）の更なる実施態様中の遺伝子エレメントの図式
前記ターゲットベクターの改変されたこの型において、この３′−Ｉ−Ｓｃｅｌ部位は第１の選択マーカー（ＳＭ１）のポリ−Ａシグナル（ｐＡ）の前に配置されている。Ｉ−Ｓｃｅｌカットターゲットベクターの再ライゲーション（相同性組み換えの代わりに末端結合（endjoning））の場合には、ｐＡエレメントがアイソレーターとして機能し、ＳＭ２の転写を妨げる。さらに、ｐＡ−エレメントにより終了されない転写産物の翻訳を終了するために、停止コドンがプロモーターのない選択マーカー２（ＳＭ２）の前に配置されている。] 図２
[0097] 図３交換ベクター（交換ベクターＡ）の実施態様中の遺伝子エレメントの図式
交換ベクターはＧＯＩのためのＣＤＳと、選択マーカーのための不完全ＣＤＳを含有する（ΔＳＭ２）。ＧＯＩのためのＣＤＳの後にだけ適当なポリアデニル化シグナルが引き続く。ＳＭ２のための不完全なＣＤＳが機能性の構成性プロモーターＰ３（ＰＳＶ４０）により駆動される一方で、ＧＯＩはその５′−末端に、ターゲットコンストラクト中のＣＭＶプロモーターの３′−部分と同一である部分プロモーターだけを含有する。] 図３
[0098] 図４交換ベクター（交換ベクターＢ）の更なる実施態様中の遺伝子エレメントの図式
この実施態様において、交換ベクターは図３ａに示したベクターの他に、第３の選択マーカー（ＳＭ３）を含有し、この発現はＩＲＥＳエレメントを介してＧＯＩの発現にカップリングしている。これにより、選択マーカー２及び３を使用する二重選択により成功して交換した発現カセットを有する細胞の単離が可能になる。] 図３ａ 図４
[0099] そのゲノム中に完全な交換ベクターをランダムに組み込んで有する細胞を除去することができるように、この実施態様においてこの交換ベクターは自殺遺伝子としてＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を含有する。]
[0100] 図５相同性組み換え（ＨＲ）によるターゲットと交換ベクターとの間の交換反応の図式
タグ化されたゲノム座にレポーター（ＲＧ１）及び選択カセット（ＳＭ１）を有するターゲットベクターは、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｉ−Ｓｃｅｌ）により隣接されている。このプロモーターＰ１は、「エンハンサーＰＣＭＶ−イントロン」エレメントとして示される。プロモーターＰ２は、ＳＶ４０−プロモーター（ＰＳＶ４０）により示される。交換ベクターは、ＧＯＩ及び非機能性選択マーカー（ΔＳＭ２）を収容する。相同性組み換え（ＨＲ）によりホーミングエンドヌクレアーゼ媒介されたＤＳＢの修復のために使用される相同領域が示される。この交換ベクター中のプロモーターＰ３は、ＳＶ４０−プロモーター（ＰＳＶ４０）により示される。] 図５
[0101] この下方部分は、発現カセットの成功した交換後のタグ化されたゲノム座を示す。]
[0102] 図６第３の選択マーカー（ＳＭ３）を使用する改変された交換反応の図式
この交換反応は、図５に示される通り、タグ化したゲノム座でのターゲットベクターと交換ベクターとの間で実施される。この実施態様において、交換ベクターはＧＯＩの他に、第３の選択マーカー（ＳＭ３）を含有し、この発現はＩＲＥＳエレメントを介してＧＯＩにカップリングしている。] 図５ 図６
[0103] 図７プライマリー細胞クローンのパネル中のｈＳＥＡＰ活性の測定
個々のクローン又はオリゴクローンの細胞集団（ｘ軸）を、ターゲットベクターの安定な組み込みのためにＳＭ１の活性に基づいて選択する。細胞を増大させ、ＲＧ１（ｈＳＥＡＰ）の活性に基づいてランダムにタグ化された組み込み座の転写活性についてスクリーニングした。レポーターｈＳＥＡＰの活性は、ｙ軸にｎｇ／ｍｌで示される。Ａ．３９の個々の細胞集団中のｈＳＥＡＰ活性の分布。Ｂ．９２の個々の細胞集団中のｈＳＥＡＰの活性の分布。] 図７
[0104] 図８可能性のある普遍的な（universal）宿主細胞の第１のスクリーニング
図７に示される通りに、ＳＭ１を用いてターゲットベクターでのトランスフェクション後に細胞の選択により細胞集団を作成する。このデータは、「アウトパフォーマー」と呼ばれる所望される高生産者細胞集団の同定を実証する。同定は、ＲＧ１（ｈＳＥＡＰ）の発現を基礎とする。レポーターｈＳＥＡＰの活性はｙ軸にｎｇ／ｍｌで示される。] 図７ 図８
[0105] 図９アウトパフォーマー０１Ａ４３８の第２のスクリーニング
ＲＧ１（ｈＳＥＡＰ）の高発現により特徴付けられるアウトパフォーマー細胞から、高発現性の、クローンの細胞集団を、血清不含条件下での単一細胞の限定された希釈（ＬＤ）クローニングにより作成する。グラフＡ及びＢは、ＲＧ１（ｈＳＥＡＰ）の活性により実証される通りの個々のクローン細胞集団の異なる発現能力を示す。レポーターｈＳＥＡＰの活性はｙ軸にｎｇ／ｍｌで示される。Ｂ中のアスタリスクは、更なる使用のためにワイルドカード細胞（０７−０２２と名付ける）として選択される細胞クローンを示す。選択は、発現及び成長特性に基づいた。] 図９
[0106] 図１０二重鎖切断媒介交換：メガヌクレアーゼプラスミド量の最適化
安定に組み込まれたターゲットベクターを有する予備形成されたワイルドカード細胞０７−０２２中での発現カセットの交換。タグ化されたワイルドカード細胞からの発現カセットを、ＧＯＩをモデルとしてＧＦＰを有するＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＳＭ３カセットに対して交換し、この場合にターゲットベクターと交換ベクターとの間でのＤＳＢ媒介ＨＲを利用した。交換を、交換ベクター（ｅｃｖ２）及びメガヌクレアーゼ（Ｍｎｖ）のための発現ベクターの同時トランスフェクションにより実施した。交換反応を最適化するために、交換ベクターの一定量を、異なる量のメガヌクレアーゼプラスミドで試験した。ターゲットと交換ベクターとの間での相同性組み換えによる発現カセットの成功した交換は、ＳＭ２（ＮｅｏＲ）を活性化するものである。１１日間のＧ４１８を用いた２×１０6の選択後に、Ｇ−４１８耐性コロニーの全数と、また同様に、ＧＦＰポジティブコロニーの量とを決定した。このグラフは、異なるアプローチにおけるＧＦＰポジティブ細胞のパーセンテージを示す。アプローチ５は、アプローチ３に比較して約６倍より多いＧＦＰ−発現クローン細胞を産出したことに留意されたい。] 図１０
[0107] 図１１二重鎖切断媒介交換：メガヌクレアーゼプラスミド量の最適化
図１０について示したアプローチからの細胞は更に、ＳＭ２の他にＳＭ３（ＺｅｏＲ）の活性を使用して選択される。二重選択後に、二重耐性コロニーの全数と、また同様に、その内でＧＦＰ−ポジティブなコロニーの量とを、ＵＶ顕微鏡により決定した。アプローチ５は最も高いパーセンテージ（〜９４％）を示し、かつ、２６１クローンでは最高の絶対数の二重耐性のかつ明るいＧＦＰ発現細胞である。] 図１０ 図１１
[0108] 図１２二重鎖切断媒介交換：メガヌクレアーゼプラスミド量の最適化
ターゲットベクターと交換ベクターとの間での二重鎖切断（ＤＳＢ）誘発された相同性組み換えによるワイルドカード細胞中での発現カセットの交換により得られるクローン細胞の例。この画像は、図１０及び１１に示されるアプローチ５からのＧＦＰポジティブコロニーのオーバーレイ（可視／ＵＶ光）を示す。スケールバーは１００μｍを示す。] 図１０ 図１２
[0109] 図１３ワイルドカード細胞クローン０１Ｃ０９０に由来するＧＦＰポジティブコロニー
異なるワイルドカード細胞集団（０１Ｃ０９０）を使用する説明した方法による成功したカセット交換の例。この画像は、カセット交換及びＳＭ２及びＳＭ３に基づく二重選択後に得られるＧＦＰ発現細胞を示す。スケールバーは１００μｍを示す。] 図１３
[0110] 図１４交換反応及び二重選択後のＧＦＰポジティブコロニー
確立されたワイルドカード細胞コロニー中の発現カセットのＤＳＢ媒介交換による成功したカセット交換の更なる例。ワイルドカード細胞クローン０７−０２２（Ａ）及びクローン０８−０１８（Ｂ）からの交換及び二重選択後に得られる細胞が比較して示される。スケールバーは１００μｍを示す。]
[0111] 図１５交換反応のＰＣＲベースの確認
３つの異なるワイルドカードクローン（０７−０２２、０８−０１８、０１Ｃ０９０）からのゲノムＤＮＡを、ＰＣＲにより交換反応前（レーン１、４、６）及び交換反応後（レーン３、５、７）に分析した。０７−０２２については、ランダムに組み込んだ交換ベクターを有するコントロールも分析した（レーン２）。（Ａ．）３６８ｂｐの産物は、交換前のｈＳＥＡＰ発現カセットの存在を確認する（レーン１、４、６）。交換後（レーン３、５、７）のこの欠失したバンドは、発現カセットの完全な除去を示す。（Ｂ．）２９３ｂｐの産物は、交換反応後（レーン３、５、７）にＧＦＰ発現カセットの存在を確認するが、これはランダムな組み込み後でもある（レーン２）。（Ｃ．）９７１ｂｐの産物は、ＳＭ２の終了後にだけ作成され、このため、ＨＲによる発現カセットの交換を示唆する（レーン３、５、７）。適したプラスミドはポジティブコントロールとして機能した（レーン８）。（Ｃ）中のコントロールは使用したプラスミドＤＮＡのための９１７ｂｐのバンドを示すことに留意されたい。ネガティブコントロールは、テンプレートＤＮＡの代わりに水（レーン９）又は親のコントロール細胞からのゲノム性ＤＮＡを含有し、如何なる改変も有しない（レーン１０）。データは異なるアガロースゲルからのデータと適合した。] 図１５
図面の簡単な説明

[0112] 図１は、ターゲットベクター（ターゲットベクターＡ）の実施態様中の遺伝子エレメントを示す図である。
図２は、ターゲットベクター（ターゲットベクターＢ）の更なる実施態様中の遺伝子エレメントを示す図である。
図３は、交換ベクター（交換ベクターＡ）の実施態様中の遺伝子エレメントを示す図である。
図４は、交換ベクター（交換ベクターＢ）の更なる実施態様中の遺伝子エレメントを示す図である。
図５は、相同性組み換え（ＨＲ）によるターゲットと交換ベクターとの間の交換反応を示す図である。
図６は、第３の選択マーカー（ＳＭ３）を使用する改変された交換反応を示す図である。
図７は、プライマリー細胞クローンのパネル中のｈＳＥＡＰ活性の測定を示す図である。
図８は、可能性のある普遍的な宿主細胞の第１のスクリーニングを示す図である。
図９は、アウトパフォーマー０１Ａ４３８の第２のスクリーニングを示す図である。
図１０は、二重鎖切断媒介交換：メガヌクレアーゼプラスミド量の最適化を示す図である。
図１１は、二重鎖切断媒介交換：メガヌクレアーゼプラスミド量の最適化を示す図である。
図１２は、二重鎖切断媒介交換：メガヌクレアーゼプラスミド量の最適化を示す図である。
図１３は、ワイルドカード細胞クローン０１Ｃ０９０に由来するＧＦＰポジティブコロニーを示す図である。
図１４は、交換反応及び二重選択後のＧＦＰポジティブコロニーを示す図である。
図１５は、交換反応のＰＣＲベースの確認を示す図である。] 図１ 図１０ 図１１ 図１２ 図１３ 図１５ 図２ 図３ 図４ 図５
[0113] ５．実施例
５．１ベクター系の作成
５．１．１ターゲットベクターの作成
ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）からの当初のＣＭＶプロモーターを、Ｎｈｅｌ及びＮｒｕｌを用いた制限により除去した。イントロンＡを有するこの伸長したＣＭＶプロモーターを、ベクターｐＭＧからＰａｃｌを用いてかつＸｂａｌでの平滑化後に除去した。この１．７ｋｂの長さの断片を、Ｎｒｕｌ及びＮｈｅｌ（Ｘｂａｌと相容性）カットｐｃＤＮＡ３．１断片中にライゲーションした。これによりベクターＣＶ００１を作成した。]
[0114] この５′Ｉ−Ｓｃｅｌ部位を、アダプター戦略によりＣＶ００１中に導入した。Ｉ−Ｓｃｅｌ部位ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ及びＨｉｎｄＩＩＩオーバーハング末端を有する相補的オリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、ＣＶ００１−ＭＮ中に生じるＣＶ００１のＨｉｎｄＩＩＩ中にクローニングして、ＣＯ００１−ＭＮを生じた。]
[0115] ＣＶ００１−ＭＮ中でｐｃＤＮＡ３．１（＋）の当初のネオマイシン耐性（ＮｅｏＲ）遺伝子をＳＭ１としてのヒグロマイシン耐性（ＨｙｇｒｏＲ）遺伝子により置換した。この終わりに、ポリＡ部位を含むＨｙｇｒｏＲ遺伝子をプラスミドから、ＨｙｇｒｏＲ−ＣＤＳが５′−末端からの最初の４ｎｔ（開始ＡＴＧを含む）を欠失し、その３′−末端にＰｃｉｌ制限部位を含むように増幅した。Ｐｃｉｌでの消化後に、このＰＣＲ産物を、ＢｓａＢＩ及びＰｃｉｌで制限した非メチル化ＣＶ００１−ＭＮ中にライゲーションした。ＢｓａＢＩ部位中へのクローニングによりこのＨｙｇｒｏＲ−ＣＤＳは、ベクターからの５′−末端への欠失したＡＴＧＡの添加により完成された。生じるベクターＣＶ００１−ＭＮ−Ｈｙｇｒｏ中では、プロモーターのないＮｅｏＲ遺伝子がＳＭ２として導入された。この終わりに、完全なＮｅｏＲ−ＣＤＳを適当なプラスミドＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。この５′−プライマーを、Ｉ−Ｓｃｅｌを導入するために使用し、さらにＰｃｉｌによりＮｅｏＲ−ＣＤＳのクローニングをさせる。この３′−プライマーは、ＢｓｔＺ１７１（ＴＡＣ）部位を導入する。]
[0116] Ｐｃｉｌ及びＢｓｔＺ１７１での制限後に、ＰＣＲ断片をゲル精製し、同じ制限酵素でもってこのベクターＣＶ００１−ＭＮ−Ｈｙｇｒｏカット中にライゲーションした。]
[0117] このターゲットベクターを完成させるために、この得られるベクターＣＶ００１−ＭＮ２−Ｈｙｇｒｏ−Ｎｅｏを、ＲＧ１としての分泌されたアルカリホスファターゼ（ｈＳＥＡＰ）遺伝子で補った。ポリＡシグナルを含むｈＳＥＡＰ−ＣＤＳを、Ｋｐｎｌ及びＸｂａｌ消化により適したベクターから除去した。この断片を、ベクターＣＶ００１−ＭＮ２−Ｈｙｇｒｏ−ＮｅｏのＫｐｎｌ及びＸｂａｌ部位中にクローニングした。この最終的なターゲットベクターをｐＣＴＶ−ＳＡＰ−Ｈｙｇ−０１と呼称した。]
[0118] ５．１．２交換ベクターの作成
ベクターＣＶＯ０１に基づいて図４による交換ベクターを作成した。ＳＭ２の非機能性の短縮した型を作成するために、ＣＶ００１からＮｅｏＲ−ＣＤＳをＢｓｔＺ１７１及びＢｌｎｌ消化により除去した。このＮｅｏＲ−ＣＤＳを、６３１ｂｐのＢｌｎｌ−Ｎａｅｌ ＮｅｏＲ−断片で置換した。この短縮されたＮｅｏＲ−遺伝子は、その機能のために決定的である酵素のＣ末端部分の２４アミノ酸をコードする配列が欠失している。] 図４
[0119] 生じるＣＶ００１−ΔＮｅｏＲベクター中では、エンハンサー及びＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含有するこのＣＭＶプロモーターの５′領域は、ＢｓｍＢＩ及びＭｕｎｌでの二重消化により除去された。これにより、ＣＶ００１中でＣＭＶイントロンＡプロモーターエレメントからのイントロンＡ配列が主として残った。この後退した３′末端のクレノー酵素での充填後に、このベクターを平滑末端リレゲーション（relegation）により閉鎖した。]
[0120] この生じるベクターＣＶ００１−ＩｎＡ−ΔＮｅｏＲは、自由に選択可能なＧＯＩの導入の準備ができており、かつ一般的な交換ベクターとして機能する。ＧＯＩのための一例として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が選択された。この特定の場合においては、ＧＦＰの発現は、ＩＲＥＳエレメントを介して第３の選択マーカー（ＳＭ３）の発現にカップリングした。ＳＭ３として、ゼオシン（Zeocine）耐性遺伝子（ＺｅｏＲ）を選択した。Ｌ−ＧＦＰのための配列、その後のＩＲＥＳエレメント及びＺｅｏＲのためのＣＤＳからなる発現カセットを、Ａｇｅｌ−Ｓａｌｌ断片としてベクターｐＭｏｎｏ−Ｚｅｏ−ＧＦＰ（Invitrogen）から除去した。このカセットは、ＥｃｏＲＶカットＣＶ００１−ＩｎＡ−ΔＮｅｏＲ中への平滑末端ライゲーションにより配置されている。この最終的なベクターは、ｐＣＥＶ−ＧＦＰＺｅｏ−０１と呼称された。]
[0121] ５．２普遍的ワイルドカード細胞株の作成
可能性のあるワイルドカード細胞株の作成のために、懸濁物中で血清不含条件下で成長に適合させ、かつ、高細胞密度（少なくとも２〜５×１０6細胞／ｍｌ）に成長できるＣＨＯ細胞株を使用した。この懸濁細胞をターゲットベクターｐＣＴＶ−ＳＡＰ−Ｈｙｇ−０１でトランスフェクトするために、ヌクレオフェクター（Nucleofector）技術を使用した。]
[0122] ヌクレオフェクション前にターゲットベクターｐＣＴＶ−ＳＡＰ−Ｈｙｇ−０１を２つの理由によりＳｓｐｌで消化した：
・不所望な細菌エレメント（複製起点、アンピシリン耐性遺伝子）の除去、これはこれらエレメントにより媒介されるターゲットベクターのサイレンシングを妨げるためである。
・宿主細胞中のゲノム中のターゲットベクターの関連する機能性エレメントの完全な組み込みの可能性の増加。]
[0123] このＳｓｐｌ消化は、ｐＵＣ ｏｒｉ及び主要なＡｍｐＲ遺伝子を含有する１．６９８ｋｂの断片を生じた。この残りの関連する７．４１ｋｂのターゲットベクターエレメントを、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用するアガロースゲル電気泳動により製造者の推奨に応じて精製した。]
[0124] このゲル精製したゲル精製したベクターを用いたヌクレオフェクションのために、懸濁物適合させたＣＨＯ細胞の高効率トランスフェクションを可能にする条件を確立させた。一般的に、トランスフェクションされた細胞の７０〜９０％の効率がルーチン的に達成できた。]
[0125] このヌクレオフェクトした細胞を２４時間に亘り回収させ、次いでＳＭ１としてのヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨｙｇｒｏＲ）の発現に基づく安定に組み込まれたターゲットベクターでの細胞のための選択に付した。ヒグロマイシンＢ（２００μｇ／ｍｌ）での選択のためにヌクレオフェクトした細胞を９６ウェルプレートに移し、モノー又はオリゴクローン細胞集団の単離を可能にする密度にした（限定された希釈）。これは、１〜６０細胞／ウェル、最も有利には１〜３０細胞／ウェルでの細胞密度により実施できた。]
[0126] これらのモノ−又はオリゴクローン細胞集団のそれぞれは、ターゲットベクターの異なるランダム組み込み部位を示す。これら組み込み部位の転写活性は、比色分析マイクロプレートアッセイを用いる上清中のｈＳＥＡＰ−レポーター遺伝子の活性により決定された。]
[0127] 約７０〜８０％のコンフルエントでこの選択された細胞を、更なる増大のために２４ウェルプレートに移した。この上清をｈＳＥＡＰ活性のアッセイのために使用した。]
[0128] 内因性アルカリホスファターゼを６５℃で３０分間のインキュベーションにより不活性化した。ｈＳＥＡＰの活性をｈＳＥＡＰ反応緩衝液（２Ｍジエタノールアミン、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ Ｌ−ホモアルギニン、ｐＨ９．８）中で３７℃で測定した。基質ｐ−ニトロフェノールリン酸（１２０ｍＭ）の加水分解をＯＤ４０５読み取りにより測定した。活性を、胎盤性アルカリホスファターゼを用いてスタンダードに対して定量化した。]
[0129] 大多数のクローンがｈＳＥＡＰレポーターの極めて低い活性を示した。安定に組み込まれたターゲットベクターを有する単離されたクローンの一分画だけが、レポーターの高発現を示した。これらのプライマリーなクローン又はオリゴクローン細胞集団中での発現レベルの変動の典型的な分布は、実施例において図７Ａ及びＢにおいて要約されるそのｈＳＥＡＰ発現により示される。「アウトパフォーマー」と呼ばれる希有高発現クローンを同定するために、３０００を超えるプライマリーなクローン／オリゴクローン細胞集団を分析した。] 図７Ａ
[0130] 最高に発現するクローンが普遍的なワイルドカード細胞として使用されることを保証するために、第２の限定された希釈を最高のｈＳＥＡＰレベルを示すクローンを用いて実施し、これは最大の発現レベルを有するサブクローンを同定するためである。この一例が、アウトパフォーマーとして第１の限定された希釈において同定されたクローン０１Ａ４３８について示されている（図８）。クローン０１Ａ４３８からの個々の細胞は第２の限定された希釈において播種され、これにより単一細胞由来の細胞集団の作成が可能になった。図９Ａ及びＢに示される通り、この生じるサブクローンは一般的には、第１のスクリーニングからの大多数の初期クローンに比較してより高いｈＳＥＡＰ発現を示した。にもかかわらず、この高発現クローンの群内でｈＳＥＡＰについて最高の発現を有するものを同定することが可能であった。更なる分析のためのクローンの選択のこの段階では、レポーター遺伝子の発現レベルに加えて、クローンの成長能力（二倍化時間）も考慮される。この更なる尺度に基づいて、クローン０７−０２２（図９においてアスタリスクでもってマークしてある）を選択した。] 図８ 図９ 図９Ａ
[0131] 要約すると、ｈＳＥＡＰについて高発現レベルを有する宿主細胞株を得るために、数千の個々のクローンを血清不含の限定された希釈クローニングにより作成した。ゲノム中へのランダムな組み込みのために、約５０％のこれらクローンだけがｈＳＥＡＰの測定可能な発現を示した。このｈＳＥＡＰ発現クローンからは、このクローンの０．３％だけが、高発現クローンとして、すなわち、「アウトパフォーマー」として同定された（全クローンの平均に対して＞２５倍の発現）。]
[0132] ５．３レポーター遺伝子の交換
ＲＧ１及びＳＭ１のＧＯＩに対する交換のために、サブクローン０７−０２２のワイルドカード細胞を、図４による交換ベクターｐＥＶ−ＧＦＰ−Ｚｅｏ−０１及び希有切断ホーミングエンドヌクレアーゼＩ−Ｓｃｅｌのための発現プラスミドと同時トランスフェクションさせた。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする配列をＧＯＩとして使用した。] 図４
[0133] ＧＦＰコード領域前のスプライス可能なイントロンＡの領域は、効率的な相同性組み換えを可能にするために十分長かったが（１０７７ｂｐ）、しかし減弱されたプロモーター活性を含む。]
[0134] 交換ベクター中のＳＭ１は、ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）のＣ末端短縮化した型である。このＮｅｏＲコード領域中の１６３ｂｐの欠失のために、この生じる短縮化したネオマイシンホスホトランスフェラーゼはＧ４１８に対する耐性を付与しない。このＮｅｏＲ遺伝子の５′領域（７１９ｂｐ）は、ターゲットベクター中の完全なＮｅｏＲとの相同性組み換えを可能にするのに十分である。この戦略は、交換ベクターのランダムな組み込みのために生じるＮｅｏＲ細胞なしにターゲットベクター中のこのプロモーターのないＮｅｏＲ遺伝子の活性化を可能にする。]
[0135] この系は、これらの細胞の選択を可能にするものであり、これは、交換ベクターを修復マトリックスとして使用する相同性組み換えによるホーミング酵素誘発されたＤＳＢｓを修復している。]
[0136] 付加的な選択マーカーとしてＳＭ３（ゼオシン耐性遺伝子）が、ＧＦＰとＺｅｏ耐性遺伝子との間でＩＲＥＳエレメントによりＧＦＰ発現カセットから発現されている。]
[0137] ＳＭ３は、交換ベクターのランダムな組み込みの頻度を決定し、かつ、他の修復事象が発現カセットの組み込み無しにネオマイシン耐性細胞が交換ベクターを、このターゲットベクター中の交換領域の欠失だけによって生じることができるかどうかをチェックするために使用されている。]
[0138] この終わりに、この二重トランスフェクションされた細胞を最初にＧ４１８で選択し、この生じたクローンの数を記録し、このクローンをＵＶ顕微鏡によりＧＦＰ発現について分析した。]
[0139] 図１０に示される通り、Ｇ４１８を用いた１１日間の選択後に、ＮｅｏＲ細胞の異種集団を獲得し、このうち４５〜６２％は明るいＧＦＰ発現を示し、その一方で残りのＮｅｏＲ細胞はＧＦＰネガティブであった。] 図１０
[0140] これら細胞は、単純な末端結合又は片側相同性組み換えによるＤＳＢの修復を示すことができた。後者の場合には、ＮｅｏＲ遺伝子に隣接するＤＳＢのみがＨＲにより修復され、その一方で、ＣＭＶプロモーターに隣接するＤＳＢが非相同性末端結合により修復される。]
[0141] ゼオシンを使用する付加的な選択により、ＧＦＰポジティブ細胞の分画は、一定量の交換プラスミドで同時トランスフェクションさせたＩ−Ｓｃｅｌ発現プラスミドＭｎｖの量に依存して９４％まで増加した（図１１）。メガヌクレアーゼのための発現ベクター及び交換ベクターとの間での最適化された比を使用する場合には（図１１中のアプローチ５）、全部で２９１のＧＦＰを発現するコロニーが検出可能であった。トランスフェクション後に配置され、かつ、Ｇ４１８及びゼオシンで選択された２×１０6個の細胞に基づいて、これは、〜１×１０-4の頻度を示す。これは、１〜２．５×１０-6の範囲内にある二重鎖切断誘発相同性組み換えについて刊行された頻度に比較して意外に良好な結果である。] 図１１
[0142] 要約すると、２つの選択マーカーの使用により、明るいＧＦＰ蛍光を示す同種の細胞集団の選択が可能になった（図１２）。] 図１２
[0143] クローン０７−０２２に加えて、更なるワイルドカードクローンを使用して、ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＺｅｏＲからなる発現カセットに対するＲＧ１及びＳＭ１の交換性を実証した（図１３及び１４）。] 図１３
[0144] 一般的に、低いｈＳＥＡＰ発現性ワイルドカードクローンを使用する交換は、Ｇ４１８及びゼオシンでの二重選択後に非蛍光性又は弱蛍光性の細胞しか生じなかった。]
[0145] 対照的に、高ｈＳＥＡＰ発現性ワイルドカードクローンは、説明したメガヌクレアーゼ媒介交換機構により発現カセットの効率的な交換及び二重耐性の明るいＧＦＰ発現細胞の作成を生じ、これは図１３においてクローン０１−Ｃ０９０について示される通りである。] 図１３
[0146] クローン０７−０２２との比較が、図１４においてワイルドカードクローン０８−０１８について示されている。また、クローン０８−０１８を用いても、発現カセットのメガヌクレアーゼ媒介交換後に、ＧＦＰ発現細胞の同種の集団を得ることが可能であった。ＧＦＰ発現の強度は、クローン０７−０２２に由来する細胞中で見ることができるものと比較可能であった。]
[0147] メガヌクレアーゼをベースとする交換反応後のワイルドカード細胞に由来する細胞は、血清不含条件下で懸濁培地中で増大でき、かつ、製造目的のために使用できる。]
[0148] 単一細胞由来の生産細胞株を保証するために、この交換した細胞は減少した労力でもって限定された希釈アプローチで迅速に作成できた。]
[0149] ５．４分子的特性決定
交換反応の間の分子的事象をモニターするために、３つの異なるプライマー組み合わせ（ＰＣＲ１〜３、表１を参照のこと）を使用するＰＣＲベースのアプローチを使用した。]
[0150] 表１分子的特性決定のためのプライマー組み合わせ]
[0151] ＰＣＲ１では、ワイルドカード宿主細胞のゲノム内で安定に組み込まれたターゲットベクターが検出可能である。ＰＣＲ２を、交換反応の実施後の細胞中での交換ベクターからの交換カセットの存在を確認するために使用する。交換ベクターはランダムに組み込み可能でもあるので、ＰＣＲ３を、このターゲットコンストラクト内の３′末端の交換領域での相同性組み換えを確認するために使用する。このＰＣＲのための５′−プライマーはＳＶ４０プロモーターに結合し、これは交換コンストラクト内に存在し、その一方でこの３′−プライマーはＮｅｏＲ−遺伝子の３′部分に結合し、これはターゲットコンストラクト中にだけ存在し交換コンストラクト中に存在しない。相同性組み換えによるプロモーターのないＳＭ２（ＮｅｏＲ−遺伝子）の活性化後に初めてこのＰＣＲ３は、９７１ｂｐのＰＣＲ産物を作成できる。]
[0152] 異なるＰＣＲ分析からのこの結果の組み合わせにより、このターゲットコンストラクトからの発現カセットの除去及びこの交換ベクターからの発現カセットの導入が実証されることができる。]
[0153] このような分析のための結果は図１５に、交換反応が成功して実施される３つの異なる普遍的なワイルドカード細胞株について要約されている。（Ａ．）部においては、ターゲットコンストラクトの存在が、ＣＭＶプロモーターエレメントのイントロン及びｈＳＥＡＰＣＤＳの５′領域中のプライマー結合により確認された。パネル（Ｂ．）は、（Ａ．）に示される同じイントロンプライマーと、ＧＦＰのためのＣＤＳの５′領域中に結合するプライマーとの組み合わせにより、交換ベクターＢの安定に組み込まれた発現カセットの確認を示す。相応するＰＣＲ産物の成功した増幅は、ＨＲ又はランダム組み込みのいずれかによる発現カセットの導入を示す。パネル（Ｃ．）は、交換ベクターとのＨＲの結果としてのターゲットベクター中の活性化したＮｅｏＲ遺伝子の存在のＰＣＲ確認を示す。このＰＣＲのためのプライマーは、交換ベクター内にだけ存在するＳＶ４０プロモーター（５′−プライマー）に、及び、ターゲットベクター内にだけ存在するＮｅｏＲ−ＣＤＳの３′部分（３′−プライマー）に結合するので、成功した増幅は、交換ベクターとターゲットベクターとの間での３′−Ｉ−Ｓｃｅｌ媒介ＤＳＢでのＨＲを示す。] 図１５
[0154] パネル（Ａ．）及び（Ｂ．）中でのポジティブコントロール（レーン８）として、ターゲットベクター及び交換ベクター２をそれぞれ使用した。パネル（Ｃ．）中のポジティブコントロールは、同一のプライマー結合配列を有するが、相互にわずかに異なる距離を有するベクター（ＣＶ００１）からなる。したがって、このポジティブコントロールは、ゲノムＤＮＡから予期されるのとは僅かにより小さいＰＣＲ産物（９７１ｂｐの代わりに９１７ｂｐ）を生じる。ネガティブコントロールとしてテンプレートＤＮＡが水により（レーン９）、又は、ＣＨＯゲノムＤＮＡの不特異的増幅をチェックするために、親のＣＨＯ細胞株からの同量のＤＮＡにより、ターゲットコンストラクトのヌクレオフェクション無しで置換されている（レーン１０）。]
[0155] クローン０７−０２２は最も強く特性決定され、かつ、出発細胞の他に成功した交換細胞のその誘導体、また、交換ベクターＢのランダムな組み込みのためのコントロールも分析した。このコントロールのために使用した細胞クローンは交換ベクターＢだけのヌクレオフェクション後にゼオシンに対する耐性及び極めて弱いＧＦＰ蛍光を示した。]
[0156] クローン０８−０１８及び０１Ｃ０９０のために、二重選択に耐えかつ明るいＧＦＰ蛍光を示す出発細胞及び成功した交換細胞を分析した。]
[0157] 全てのクローンについて、出発細胞集団中でｈＳＥＡＰ−ＣＤＳの存在が明らかに実証できた（パネルＡ）。クローン０７−０２２について、ＣＤＳの存在が、ランダムな組み込みにより作成した細胞クローンについて確認されることもできた。メガヌクレアーゼ媒介交換反応後に、このｈＳＥＡＰ−ＣＤＳはもはやその全ての、ＮｅｏＲ／ＺｅｏＲ及び明るいＧＦＰ蛍光を示す試験した交換したクローン中で増幅可能でなかった。これは、全ての分析された例における組み込まれたターゲットベクターからの初期の発現カセットの除去を示す。]
[0158] この知見と一致して、交換ベクターＢからの発現カセットの存在もまた、交換反応実施後に初めてＧＦＰ−ＣＤＳについてＰＣＲにより実証されることができた（パネルＢレーン３、５、７）。この試験したクローンのための出発細胞は、このＰＣＲアッセイにおいてネガティブであった（パネルＢ、レーン１、４、６）。このＰＣＲアッセイは、ＨＲによるＧＦＰ−発現カセットの導入に特異的でない。クローン０７−０２２からの交換ベクターＢのランダムな組み込みについての例は、ここでもこのＧＦＰ−ＣＤＳ特異的プライマーを用いてポジティブなシグナルが得ることができることを示した。]
[0159] 交換反応実施後に得られるこの異なる細胞集団中でのこのＧＦＰ発現の明るい強度は、ＧＦＰ−ＣＤＳの導入が、レーン３、５及び７において使用された細胞内でタグ化された発現ホットスポット内で生じたことを示す。]
[0160] 観察されたフェノタイプがターゲットベクター中での発現カセットの除去及び同じ位置での交換ベクターからの発現カセットの導入に基づくことを最終的に確認するために、付加的なＰＣＲアッセイを実施した（パネルＣ）。このＰＣＲは、ターゲットベクター中での３′Ｉ−Ｓｃｅｌ媒介ＤＳＢが修復マトリックスとして交換ベクター２を使用するＨＲにより修復されている場合には、予期される９７１ｂｐのＰＣＲ産物しか生じない。予期された通り、二重耐性の、明るいＧＦＰ細胞中でだけ予期されたＰＣＲ産物が検出でき（パネルＣ、レーン３、５、７）、交換ベクターのランダムな組み込みから生じる細胞中では検出できない（パネルＣ、レーン２）。]

权利要求:

請求項1
以下の工程：（ａ）以下のものを含むターゲットベクターを提供する工程、（ｉ）第１の発現コントロール配列（Ｐ１）に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（ＲＧ１）、（ｉｉ）第２の発現コントロール配列（Ｐ２）に作動可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）、（ｉｉｉ）発現コントロール配列に対する作動可能な連結なしの第２の非機能性選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）、その際、配列（ｉ）は５′位に存在し、配列（ｉｉ）は（ｉ）と（ｉｉｉ）との間に存在し、配列（ｉｉｉ）は３′位に存在する、（ｉｖ）二重鎖切断媒介酵素のための第１の及び第２の認識部位、その際第１の認識部位は第１の発現コントロ−ル配列（Ｐ１）と第１のレポーター遺伝子（ＲＧ１）との間に存在し、第２の認識部位は配列（ｉｉ）と配列（ｉｉｉ）との間に存在する、（ｂ）ターゲットベクターを宿主細胞中に、宿主細胞のゲノム中へのターゲットベクターのランダムな組み込みを可能にする条件下で導入する工程、（ｃ）安定に組み込まれたターゲットベクターを有し、かつ、レポーター遺伝子（ＲＧ１）の転写活性を示す宿主細胞を選択する工程、（ｄ）以下のものを含有する交換ベクターを提供する工程、（ｉ）興味のある遺伝子（ＧＯＩ）及び（ｉｉ）第３の発現コントロ−ル配列（Ｐ３）に作動可能に連結された不活性な第２の選択マーカー遺伝子（ΔＳＭ２）、その際、交換ベクターは、第１の５′−相同性配列と第２の３′−相同性配列とを含有し、これはターゲットベクターの配列との組み換えを可能にする、（ｅ）（ａ）（ｉｖ）で定義された第１の及び／又は第２の認識部位での二重鎖切断及び二重鎖切断媒介相同性組み換えによる宿主細胞のゲノム中への交換ベクターの組み込みを可能にする条件下で、工程（ｃ）で得られた宿主細胞中に交換ベクターを導入する工程、これにより、この不活性な第２の選択マーカー遺伝子（ΔＳＭ２）は、ターゲットベクターとの相同性組み換えによる交換ベクターの組み込みにより活性化される、（ｆ）組み込まれたターゲットベクターとの相同性組み換えによる組み込まれた交換ベクターを有する生産者細胞を選択する工程、その際、この生産者細胞はＧＯＩを発現する、を含む組み換え遺伝子産物の製造のための生産者宿主細胞の作成方法。
請求項2
宿主細胞が、真核細胞、特に哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞である請求項１記載の方法。
請求項3
レポーター遺伝子（ＲＧ１）が、酵素又はルミネッセンスの又は蛍光の遺伝子産物をコードする請求項１又は２記載の方法。
請求項4
第１の発現コントロール配列（Ｐ１）が、構成性プロモーター、例えばＣＭＶプロモーターを含有し、場合によりこれはＣＭＶイントロンＡで補われている請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
請求項5
第２の発現コントロール配列（Ｐ２）が、構成性プロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター、又はＩＲＥＳエレメントを含有する請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
請求項6
不活性な第２の選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）が、ＡＴＧ開始コドン無し及び／又は上流の停止コドン有りである請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
請求項7
二重鎖切断誘発酵素がメガヌクレアーゼ又はホーミングヌクレアーゼであり、これは少なくとも１０、有利には少なくとも１２、より有利には１８ヌクレオチドの認識部位を有し、かつ、例えばＩ−Ｓｃｅｌ、Ｉ−Ｓｃｅｌｌ、Ｉ−Ｓｃｅｌｌｌ、Ｉ−ＳｃｅｌＶ、Ｉ−Ｃｅｕｌ、Ｉ−Ｃｒｅｌ、Ｉ−Ｐｐｏｌ、Ｉ−Ｔｅｖｌ、Ｉ−Ｔｅｖｌｌ、Ｉ−Ｔｅｖｌｌｌ、ＨＯ及びＥｎｄｏＳｃｅｌから選択される請求項１から６までいずれか１項記載の方法。
請求項8
第２の認識部位が、転写アイソレーター、例えばポリＡ部位の前に存在する請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
請求項9
第１の及び第２の認識部位が、相互に対して反対の配向にある請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
請求項10
宿主細胞の染色体の単一部位中に特に単一コピーとして組み込まれたターゲットベクターを有する細胞が選択される請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
請求項11
選択工程（ｃ）が、第１の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）活性の検出を基礎とする請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
請求項12
レポーター遺伝子（ＲＧ１）の高い転写活性を有する宿主細胞が選択される請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
請求項13
交換ベクターが、機能性発現コントロール配列なしの興味のある遺伝子（ＧＯＩ）を含有し、これが特に、ターゲットベクター中の第１の発現コントロール配列（Ｐ１）の３′−部と実質的に同一である部分発現コントロール配列を有する請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
請求項14
交換ベクターが、第３の発現コントロール配列（Ｐ３）に作動可能に連結された不完全な第２の選択マーカー遺伝子（ΔＳＭ２）を含有し、特にこれが構成性プロモーター、例えばＳＶ４０プロモーターを含有する請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法。
請求項15
交換ベクターがさらに、（ｉｉｉ）第３の選択マーカー遺伝子（ＳＭ３）を含有し、これがＧＯＩと同時転写される請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法。
請求項16
第１の５′−相同性配列が少なくとも約１０００ヌクレオチドの長さを有し、かつ／又は、第２の３′−相同性配列が少なくとも約７００ヌクレオチドの長さを有する請求項１から１５までのいずれか１項記載の方法。
請求項17
交換ベクター中の第１の５′−相同性配列が機能性発現コントロール配列を含有しない請求項１から１６までのいずれか１項記載の方法。
請求項18
交換ベクター中の第２の３′−相同性配列が機能性選択マーカー遺伝子配列を含有しない請求項１から１７までのいずれか１項記載の方法。
請求項19
交換ベクターがさらに、（ｉｖ）ネガティブ選択マーカー遺伝子、特に自殺遺伝子、例えばＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子を含有し、これが第１の５′−及び第２の３′−相同性配列により定義される配列の外側に存在する請求項１から１８までのいずれか１項記載の方法。
請求項20
更に以下の工程（ｉ）二重鎖切断媒介酵素をコードする核酸配列又は二重鎖切断媒介酵素をコードするｍＲＮＡを含有するベクターを、工程（ｅ）前又は間に宿主細胞中に導入し、工程（ｅ）の性能を発揮させるためにこの酵素を発現させる工程、又は（ｉｉ）二重鎖切断媒介酵素を工程（ｅ）前又は間に宿主細胞中に導入し、工程（ｅ）の性能を発揮させるためにこの酵素を提供する工程を含む請求項１から１９までのいずれか１項記載の方法。
請求項21
選択工程（ｆ）が、第２の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）活性の検出を基礎とする請求項１５から２０までのいずれか１項記載の方法。
請求項22
選択工程（ｆ）が、第２の選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）及び第３の選択マーカー遺伝子（ＳＭ３）活性の検出を基礎とする請求項１から２１までのいずれか１項記載の方法。
請求項23
さらに興味のある遺伝子（ＧＯＩ）を発現させ、かつ、この発現した遺伝子産物を獲得することを含む請求項１から２２までのいずれか１項記載の方法。
請求項24
以下の工程：（ａ）以下のものを含むターゲットベクターを提供する工程、（ｉ）第１の発現コントロール配列（Ｐ１）に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（ＲＧ１）、（ｉｉ）第２の発現コントロール配列（Ｐ２）に作動可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）、（ｉｉｉ）発現コントロール配列に対する作動可能な連結なしの第２の非機能性選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）、その際、配列（ｉ）は５′位に存在し、配列（ｉｉ）は（ｉ）と（ｉｉｉ）との間に存在し、配列（ｉｉｉ）は３′位に存在する、（ｉｖ）二重鎖切断媒介酵素、特にメガヌクレアーゼのための第１の及び第２の認識部位、その際第１の認識部位は第１の発現コントロ−ル配列（Ｐ１）と第１のレポーター遺伝子（ＲＧ１）との間に存在し、第２の認識部位は配列（ｉｉ）と配列（ｉｉｉ）との間に存在する、（ｂ）ターゲットベクターを宿主細胞中に、宿主細胞のゲノム中へのターゲットベクターのランダムな組み込みを可能にする条件下で導入する工程、及び（ｃ）安定に組み込まれたターゲットベクターを有し、かつ、レポーター遺伝子（ＲＧ１）の転写活性を示す宿主細胞を選択する工程を含む興味のある遺伝子（ＧＯＩ）の導入のためのワイルドカード宿主細胞の作成方法。
請求項25
以下の工程：（ａ）以下のものを含む発現カセットをそのゲノム中に組み込んで有するワイルドカード宿主細胞を提供する工程、（ｉ）第１の発現コントロール配列（Ｐ１）に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（ＲＧ１）、（ｉｉ）第２の発現コントロール配列（Ｐ２）に作動可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）、（ｉｉｉ）発現コントロール配列に対する作動可能な連結なしの第２の非機能性選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）、その際、配列（ｉ）は５′位に存在し、配列（ｉｉ）は（ｉ）と（ｉｉｉ）との間に存在し、配列（ｉｉｉ）は３′位に存在する、（ｉｖ）二重鎖切断媒介酵素のための第１の及び第２の認識部位、その際第１の認識部位は第１の発現コントロ−ル配列（Ｐ１）と第１のレポーター遺伝子（ＲＧ１）との間に存在し、第２の認識部位は配列（ｉｉ）と配列（ｉｉｉ）との間に存在する、その際この発現カセットは宿主細胞ゲノム中に安定に組み込まれており、かつ、レポーター遺伝子（ＲＧ１）の転写活性を示す、（ｂ）以下のものを含有する交換ベクターを提供する工程、（ｉ）興味のある遺伝子（ＧＯＩ）及び（ｉｉ）第３の発現コントロ−ル配列（Ｐ３）に作動可能に連結された不活性な第２の選択マーカー遺伝子（ΔＳＭ２）、その際、この交換ベクターは、第１の５′−相同性配列と第２の３′−相同性配列とを含有し、これはターゲットベクターの配列との組み換えを可能にする、（ｃ）（ａ）（ｉｖ）で定義された第１の及び／又は第２の認識部位での二重鎖切断及び二重鎖切断媒介相同性組み換えによる宿主細胞のゲノム中への交換ベクターの組み込みを可能にする条件下で、工程（ａ）で提供された宿主細胞中に交換ベクターを導入する工程、これにより、この不活性な第２の選択マーカー遺伝子（ΔＳＭ２）は、交換ベクターの組み込みにより活性化される、（ｄ）組み込まれたターゲットベクターとの相同性組み換えによる組み込まれた交換ベクターを有する生産者細胞を選択する工程、その際、この生産者細胞はＧＯＩを発現する、を含む組み換え遺伝子産物の製造方法。
請求項26
以下の工程：（ａ）転写活性を支持する宿主細胞のゲノムの部位中に標的化した相同性組み換えにより二重鎖切断媒介酵素のための第１の及び第２の認識部位を含有する核酸配列を導入する工程、（ｂ）安定に組み込まれた第１の及び第２の認識部位を有するワイルドカード宿主細胞を選択する工程、（ｃ）以下のものを含有する交換ベクターを提供する工程、（ｉ）興味のある遺伝子（ＧＯＩ）及び（ｉｉ）第１の５′−相同性配列及び第２の３′−相同性配列、これにより第１の及び／又は第２の組み込み部位の組み込み部位での配列との組み換えが可能になる、（ｄ）（ａ）で定義された第１の及び／又は第２の認識部位での二重鎖切断及び二重鎖切断媒介相同性組み換えによる宿主細胞のゲノム中への交換ベクターの組み込みを可能にする条件下で、工程（ｂ）で得られた宿主細胞中に交換ベクターを導入する工程、及び（ｅ）相同性組み換えによる組み込まれた交換ベクターを有する生産者細胞を選択する工程、その際、この生産者細胞はＧＯＩを発現する、を含む組み換え遺伝子産物の製造のための生産者宿主細胞の作成方法。
請求項27
以下の工程：（ａ）転写活性を支持する宿主細胞のゲノムの部位中に標的化した相同性組み換えにより二重鎖切断媒介酵素のための第１の及び第２の認識部位を含有する核酸配列を導入する工程、及び（ｂ）安定に組み込まれた第１の及び第２の認識部位を有するワイルドカード宿主細胞を選択する工程を含む興味のある遺伝子（ＧＯＩ）の導入のためのワイルドカード宿主細胞の製造方法。
請求項28
（ａ）二重鎖切断媒介酵素のための第１の及び第２の認識部位を含有する核酸配列をそのゲノム中に組み込んで有するワイルドカード宿主細胞を提供し、その際この核酸配列は転写活性を支持する部位で宿主細胞ゲノム中に安定に組み込まれている、（ｂ）以下のものを含有する交換ベクターを提供し、（ｉ）興味のある遺伝子（ＧＯＩ）及び（ｉｉ）第１の５′−相同性配列及び第２の３′−相同性配列、これにより第１の及び／又は第２の認識部位の組み込み部位での配列との組み換えが可能になる、（ｃ）（ａ）で定義された第１の及び／又は第２の認識部位での二重鎖切断及び二重鎖切断媒介相同性組み換えによる宿主細胞のゲノム中への交換ベクターの組み込みを可能にする条件下で、工程（ａ）で提供された宿主細胞中に交換ベクターを導入し、かつ（ｄ）相同性組み換えによる組み込まれた交換ベクターを有する生産者細胞を選択し、その際、この生産者細胞はＧＯＩを発現する、組み換え遺伝子産物の製造のための方法。
請求項29
（ａ）第１の発現コントロール配列（Ｐ１）に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（ＲＧ１）、（ｂ）第２の発現コントロール配列（Ｐ２）に作動可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）、（ｃ）発現コントロール配列に対する作動可能な連結なしの非機能性の第２の選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）、その際、配列（ｉ）は５′位に存在し、配列（ｉｉ）は（ｉ）と（ｉｉｉ）との間に存在し、配列（ｉｉｉ）は３′位に存在する、（ｄ）二重鎖切断媒介酵素、特にメガヌクレアーゼのための第１の及び第２の認識部位、その際第１の認識部位は第１の発現コントロ−ル配列（Ｐ１）と第１のレポーター遺伝子（ＲＧ１）との間に存在し、第２の認識部位は配列（ｉｉ）と配列（ｉｉｉ）との間に存在する、を含有するターゲットベクター。
請求項30
（ｉ）興味のある遺伝子（ＧＯＩ）及び（ｉｉ）第３の発現コントロ−ル配列（Ｐ３）に作動可能に連結された不活性な第２の選択マーカー遺伝子（ΔＳＭ２）、その際、交換ベクターは、第１の５′−相同性配列と第２の３′−相同性配列とを含有し、これは宿主細胞のゲノム中の予め定められた部位の配列との組み換えを可能にする、宿主細胞中に興味のある遺伝子（ＧＯＩ）を導入するための交換ベクター。
請求項31
相同性配列が、請求項２９に定義されるターゲットベクターの配列との組み換えを可能にする請求項３０記載の交換ベクター。
請求項32
請求項１から２３又は２６のいずれか１項記載の方法により得られる組み換え遺伝子産物の製造のための生産者細胞。
請求項33
請求項２４又は２７記載の方法により得られる興味のある遺伝子（ＧＯＩ）の導入のためのワイルドカード宿主細胞。
請求項34
さらに、二重鎖切断媒介酵素をコードする核酸配列を含有し、これは有利には誘導性発現コントロール配列に作動可能に連結されている請求項３３記載のワイルドカード宿主細胞。
請求項35
請求項３０又は３１記載の交換ベクターと組み合わせた請求項３３又は３４記載のワイルドカード宿主細胞。
請求項36
生産者細胞株の作成のための請求項３３、３４又は３５記載のワイルドカード宿主細胞の使用。
請求項37
組み換え遺伝子産物の製造のための請求項３２記載の生産者細胞又は請求項３６記載の使用により得られる生産者細胞の使用。